本發明涉及一種培養基及其制備方法和應用，尤其涉及一種豬肺炎支原體培養基及其制備方法和應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
豬支原體肺炎又稱豬地方性流行肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，我國俗稱豬喘氣病，是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一種慢性、接觸性、呼吸道傳染病。主要臨診癥狀是咳嗽和氣喘，常有其他病菌(如多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌等)繼發感染。本病廣泛分布于世界各地，在我國許多地區的豬場都有發生。豬只感染后通常會生長發育不良，生產性能顯著下降，從而導致飼料轉化率降低，藥物治療成本增加，且易繼發病毒或細菌感染，造成豬死亡率升高，導致經濟損失慘重。由國內外臨床經驗可知，疫苗免疫是預防本病最重要的手段。
目前培養豬肺炎支原體的培養基主要有Friis培養基，KM2培養基，A26培養基及專利配方培養基(專利公布號：103060220A)。在以上所有培養基及培養方式上，仍然需要進一步降低血清的使用劑量，甚至無血清培養基的培養方式，同時提高疫苗抗原含量，才能達到目前的生產需求。
技術實現要素：
本發明所要解決的問題是提供一種豬肺炎支原體培養基及其制備方法和應用，用以降低培養豬肺炎支原體所需血清用量，提高豬肺炎支原體疫苗抗原效價。具體如下：
本發明的一方面，提供一種豬肺炎支原體培養基，其由基礎培養基和輔助培養基經無菌處理后，用注射水定容制成，其中基礎培養基和輔助培養基的組分分別為：
基礎培養基：
輔助培養基：
如上所述的豬肺炎支原體培養基，每1000mL培養基中含有豬血清和雞血清50-80mL，即整體培養基中血清添加的體積比例為5-8％。
本發明的另一方面，提供一種豬肺炎支原體培養基的制備方法，其包括下列步驟：
(1)制備基礎培養基：取(1)-(8)成分配比逐一溶入200-400mL注射水中，在115℃滅菌20min，待冷卻后備用；
(2)制備輔助培養基：取(9)-(14)成分過濾除菌，(15)和(16)成分經滅活、輻照處理，逐一溶入200-400mL滅菌的注射水中，即得輔助培養基；
(3)將基礎培養基和輔助培養基混合，以滅菌注射水定容制成1000ml，用無菌1mol/L NaOH調節pH值7.6-7.8，分裝備用。
本發明的再一方面，提供上述培養基在豬肺炎支原體疫苗抗原制備中的應用。
本發明所述豬肺炎支原體培養基具有以下特點：
(1)本發明培養基中血清含量低，降低了生產成本，同時減輕了血清對豬體的過敏應激反應，降低了豬肺炎支原體成品疫苗副反應發生率；
(2)應用本發明培養基制備疫苗抗原，豬肺炎支原體生長速度快，培養時間僅為2-3日，半成品菌液含菌量高達1.0×109-10CCU/mL，遠高于行業標準要求，適合工業化大生產；
(3)應用本發明方法制備的豬肺炎支原體疫苗，抗原含量高，免疫效果好，免疫力堅強，能抵御豬肺炎支原體強毒的攻擊。
具體實施方式
下面結合具體實施方式做進一步的說明，以下實施例僅用于說明，而不用于限制本專利的保護范圍。
實施例1配制豬肺炎支原體培養基
1、制備基礎培養基：
1×漢克氏平衡鹽緩沖液配制方法：NaCl 80.0g，CaCl21.4g，KCl 4g，MgCl2·6H2O 1.0g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H2O 1.0g，Na2HPO4·12H2O 1.52g，酚紅0.4g，加注射水至1000mL。
取上述的(1)-(8)成分配比逐一溶入300mL注射水中，115℃滅菌20min，待冷卻后備用；
2、制備輔助培養基：
取(9)-(14)成分過濾除菌，(15)和(16)成分經滅活、輻照處理，逐一溶入300mL滅菌的注射水中，即得輔助培養基；
3、將基礎培養基和輔助培養基混合，以滅菌注射水定容制成1000ml，用無菌1mol/L NaOH調節pH值7.8，分裝備用。
實施例2配制豬肺炎支原體培養基
1、制備基礎培養基：
取上述的(1)-(8)成分配比逐一溶入300mL注射水中，在115℃滅菌20min，待冷卻后備用；
2、制備輔助培養基：
取(9)-(14)成分過濾除菌，(15)和(16)成分經滅活、輻照處理，逐一溶入300mL滅菌的注射水中，即得輔助培養基；
3、將基礎培養基和輔助培養基混合，以滅菌注射水定容制成1000ml，用無菌1mol/L NaOH調節pH值7.8，分裝備用。
實施例3應用豬肺炎支原體分別通過本發明培養基和不完全培養基(缺少部分成分)進行比較增殖培養：
1、制備培養基
將豬肺炎支原體J株(凍干菌種由瑞普(保定)生物藥業有限公司生產部提供)分別接種于本發明的培養基1(同實施例1)及培養基2(根據實施例1要求進行配置，但未添加胃黏液素、精氨酸溶液、酪氨酸溶液、絲氨酸溶液、氯化膽堿及雞血清)。
2、接菌培養
豬肺炎支原體J株種子繼代復壯后，按照10％(V/V)分別接種，37℃培養，當培養基顏色變黃、pH值由7.8降至6.8時，取出培養物。
3、活菌滴度(CCU)測定
取6組無菌試管，每3組作為一種培養液的平行重復試驗管，測定取13個10mL管制玻璃瓶，每瓶分裝待檢培養基1.8mL，接種0.2mL連續復壯后的菌種培養物至第一瓶，振蕩混勻，吸取0.2mL再接種至第2瓶，依次做10倍系列稀釋至第12瓶，第13瓶設未添加菌液的培養基為陰性對照。靜置37℃培養，每日觀察記錄培養基顏色變化情況，第14日判定結果，如培養基對照管不變色，液體培養物按其稀釋度依次有顏色變化，則試驗成立。每組管制玻璃瓶中液體培養物變色的最高稀釋度即為該培養物的CCU滴度，記錄3組平行實驗結果。
4、結果
由CCU測定可知，本發明制備的培養基1測得3個平行組的結果分別為109CCU/mL，109CCU/mL，1010CCU/mL，結果換算成4×109CCU/mL；而培養基2測得3個平行組的結果分別為107CCU/mL，107CCU/mL，108CCU/mL，結果換算成4×107CCU/mL。
未添加胃黏液素、精氨酸溶液、酪氨酸溶液、絲氨酸溶液、氯化膽堿及雞血清的培養基2與已添加上述成份的培養基1，培養效果差異顯著，差距約100倍，說明在本發明中的相關成份對豬肺炎支原體培養效果有一定作用。
實施例4配制豬肺炎支原體培養基
選擇本發明支原體培養基(血清含量為5％)、A26培養基(血清含量為20％)及KM2培養基(血清含量為20％)對豬肺炎支原體J株進行比較增殖培養：
1、豬肺炎支原體菌液培養與制苗菌液制備：
將豬肺炎支原體(J株)生產用種子按10％(V/V)分別接種于以上3種培養基(200mL)中，37℃培養，pH值降低至6.7-6.8時收獲；將上述傳代后的菌液按10％(V/V)的量接種于以上3種培養基(2000mL)同樣方法再次傳代，直至收獲菌液量擴大至200000mL，取適量上述半成品菌液進行活菌數測定，共測定3次。
2、活菌滴度(CCU)測定：
分別取以上3種培養基制備的豬肺炎支原體J株制苗菌液依次10倍系列稀釋至第12管，再設培養基作陰性對照，置溫度37℃恒溫培養箱內培養，每日觀察記錄培養基顏色變化和混濁度變化，第14日判定結果，如培養基對照管不變色，則試驗成立。最后發生顏色變化的稀釋度即為該培養物的CCU滴度，3種菌液各測定3次，培養時間(培養周期)及含菌量的測定結果見表1：
表1豬肺炎支原體J株接種3種培養基制備制苗菌液的結果
3種培養基豬肺炎支原體培養時間差異明顯：豬肺炎支原體J株在本發明制備的培養基中生長最快，為2-3日；KM2培養基生長時間為3-5日，A26培養基為4-5日。
3種培養基豬肺炎支原體半成品菌液的含菌量測定結果：本發明培養基、KM2培養基和A26培養基制備的制苗用菌液含菌量依次降低，且達到最終含菌量的時間依次延長，含菌量(和達到最終含菌量的測定時間)分別為4.0×109CCU/ml(10日)，1.0×108CCU/ml(13日)，7.0×107CCU/ml(14日)，說明本發明培養基制備豬肺炎支原體J株半成品菌液具有生長迅速，含菌量高的特點。
實施例5配制豬肺炎支原體培養基
用實施例3中應用本發明培養基培養的豬肺炎支原體(J株)半成品菌液制備豬肺炎支原體滅活疫苗，并進行疫苗的安全檢驗和效力檢驗。
1、豬肺炎支原體(J株)滅活疫苗制備
(1)滅活：在豬肺炎支原體菌液中加入質量濃度(m：V)37％的甲醛溶液滅活，甲醛溶液：豬肺炎支原體菌液＝1.5：1000(V：V)，37℃滅活24h，每1h搖勻一次。
(2)乳化：取水相5份加入到磁力攪拌罐中，在低速攪拌的同時，緩慢加入油相1份，以300r/min攪拌30分鐘，即制得豬肺炎支原體(J株)滅活疫苗。
2、安全檢驗：取14日齡健康仔豬5頭，頸部肌肉注射疫苗，連續觀察14天并定期測定體溫。結果表明，注射部位吸收良好，注苗仔豬無體溫升高現象，飲食及精神狀態無異常，安全檢驗合格。
3、效力檢驗：取30日齡仔豬10頭，疫苗免疫后攻擊強毒，根據肺部病變評分，按照標準免疫豬的肺部病變減少率應不低于60％；本次生產的疫苗免疫豬肺炎病變減少率平均高于80％，效力檢驗合格。