本發明涉及抗原物質純化
技術領域：
，進一步涉及用于疫苗的支原體的純化技術，具體涉及一種純化豬肺炎支原體的方法。
背景技術：
：豬支原體性肺炎，是一種由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)所引起的慢性接觸性呼吸道傳染病，以氣喘為主要癥狀，又稱豬氣喘病。該病分布范圍廣、感染率高、死亡率低，患病豬生長減慢、飼料轉化率降低、容易引起他細菌或病毒的繼發性或混合性感染，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒、肺炎鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬鼻支原體以及多殺性巴氏桿菌等。疫苗是豬支原體性肺炎防治的重要生物制品，而疫苗的開發過程中又以抗原性能最為關鍵，從使用效果層面來看，無論滅活抗原還是減毒或抗原都應當具有顯著的免疫原性，同時對機體刺激小、不良反應率低，為了獲得好的免疫原性，抗原的純化至關重要。目前應用較廣的滅活疫苗是輝瑞公司生產的豬肺炎支原體滅活疫苗瑞倍適，其應用的佐劑Amphigen具有較好的免疫刺激能力。國內使用較多的是由江蘇農科院研制的Mhp168株弱毒活疫苗，采用肺內注射方式免疫。豬肺炎支原體的培養和保存難度大，傳統的培養凍干方法所用血清或其它蛋白注射后會引起嚴重引起過敏反應，因此制備高純度抗原、去除培養基中血清等雜蛋白、優化疫苗生產下游工藝迫在眉睫。現有技術的疫苗制備工藝中，豬肺炎支原體抗原的純化效果有待提升，一方面其抗原回收率較低，同時還存在著雜蛋白去除不完全的現象，此外，現有技術的相關方法流程繁瑣，不易于生產規模的放大。技術實現要素：本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種純化豬肺炎支原體的方法，以解決現有技術的豬肺炎支原體純化工藝抗原回收率低的技術問題。本發明要解決的另一技術問題是現有技術的豬肺炎支原體純化工藝難以充分去除雜質。本發明要解決的再一技術問題是現有技術的豬肺炎支原體純化工藝處理量有限，不利于生產規模的放大。為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養液，澄清處理，收集產物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產物用緩沖液進行3～7倍體積洗濾后，收集產物。作為優選，步驟1)所述豬肺炎支原體抗原培養液中所含有的抗原是豬肺炎支原體活抗原或滅活的豬肺炎支原體抗原。作為優選，步驟1)所述澄清處理是利用濾膜、膜包或中空纖維超濾膜實現的。作為優選，步驟2)所述超濾濃縮是利用中空纖維膜過濾系統實現的。作為優選，所述中空纖維膜過濾系統中中空纖維柱孔徑為300～700KD。作為優選，步驟2)超濾濃縮的倍數是2～5倍體積。作為優選，步驟2)所述超濾濃縮過程中，剪切速率為2000～6000sec-1，更優的，是4000sec-1。作為優選，步驟2)所述超濾濃縮過程中，跨膜壓為5～10psi，更優的，是7.5psi。作為優選，步驟3)所述的緩沖液是pH值為7.2～7.4的PBS溶液。作為優選，步驟3)所述洗濾是等體積洗濾。作為優選，步驟2)所述的超濾濃縮、步驟3)所述洗濾過程均為收集回流液、棄去透過液。在以上技術方案中，步驟2)所述的超濾濃縮可以對抗原液進行2～20倍、甚至更大體積的濃縮。本發明提供了一種純化豬肺炎支原體的方法，該技術方案以抗原培養液直接作為原料，先后經澄清處理、超濾濃縮、洗濾三步處理即告完成，在此基礎上基于實驗手段設計了所采用的工藝裝置，利用中空纖維膜剪切力低、容塵量高的特點，并優化了操作條件，通過跨膜壓、剪切速率的限定保證了抗原自身穩定，并確保了雜質去除率。應用本方法純化豬肺炎支原體抗原，不進行濃縮的情況下，抗原回收率達到87.8％以上，抗原液中豬血清去除60.7％；5倍濃縮后雜蛋白去除率達98％，抗原回收率62％，豬血清含量與原抗原液相比降低90.3％。同時，由于本方法處理量大、處理速度快、操作簡單、工藝穩定，因此可以實現自動化或半自動化生產。應用本方法純化的豬肺炎支原體抗原制備的疫苗，對于降低豬肺炎支原體疫苗產品副反應、提升產品質量具有重要意義。具體實施方式以下將對本發明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數值不限于該準確數值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數值在正負百分之十(10％)的范圍內變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數值。此外，在“大約第一數值到第二數值”的表述中，大約同時修正第一和第二數值兩個數值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例1豬肺炎支原體抗原的制備按發酵罐體積70％加入豬肺炎支原體液體培養基，121℃滅菌20min，待培養基自然冷卻到37℃時，加入20％豬血清，攪拌均勻；按培養基總量的10％接入生產用豬肺炎支原體種子液，37℃攪拌培養3～7日，待PH值由7.5下降至6.8時收獲菌液。實施例2豬肺炎支原體抗原的純化收獲的豬肺炎支原體抗原液應用3～6um濾膜澄清；應用300KD的中空纖維系統對澄清的抗原液進行純化，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積的1/2，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，收獲的截留液即為純化的豬肺炎支原體抗原。以下通過BCA法測定純化前后總蛋白含量，并以此計算蛋白去除率，實驗結果如表1所示。通過雙抗體夾心Elisa法測定純化前后抗原回收率，實驗結果如表2所示。通過豬血清白蛋白殘留試劑盒測定純化前后豬血清殘余量，實驗結果如表3所示。表1以BCA法檢測的純化前后總蛋白含量及相對應的蛋白去除率純化前(mg/ml)純化后(mg/ml)蛋白去除率16.413.915.2％表2以雙抗體夾心Elisa法檢測的純化前后抗原回收率表3以豬血清白蛋白殘留試劑盒檢測的純化前后豬血清殘余量樣品名稱濃度ug/ml體積ml質量mg豬血清去除率純化前315.920063.18-純化后132.820026.5658％實施例3豬肺炎支原體滅活抗原的純化收獲得豬肺炎支原體抗原液按終濃度0.2％加入甲醛，37℃滅活24h；將滅活的豬肺炎支原體抗原液用3～6um濾膜澄清；應用300KD的中空纖維系統對澄清的抗原液進行純化，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積的1/2，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液稀釋至原體積，收獲的截留液即為純化的豬肺炎支原體抗原。以下通過BCA法測定純化前后總蛋白含量，并以此計算蛋白去除率，實驗結果如表4所示。通過雙抗體夾心Elisa法測定純化前后抗原回收率，實驗結果如表5所示。通過豬血清白蛋白殘留試劑盒測定純化前后豬血清殘余量，實驗結果如表6所示。表4以BCA法檢測的純化前后總蛋白含量及相對應的蛋白去除率純化前(mg/ml)純化后(mg/ml)蛋白去除率16.414.213.4％表5以雙抗體夾心Elisa法檢測的純化前后抗原回收率表6以豬血清白蛋白殘留試劑盒檢測的純化前后豬血清殘余量樣品名稱濃度ug/ml體積ml質量mg豬血清去除率純化前315.920063.18-純化后124.120024.8260.7％實施例4豬肺炎支原體滅活抗原的濃縮收獲的豬肺炎支原體抗原液應用3～6um濾膜澄清；應用300KD的中空纖維系統對澄清的抗原液進行濃縮純化，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積的1/5，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液兩倍稀釋，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液兩倍稀釋，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，保留截留液；用無菌PBS(PH7.2)將上述抗原濃縮液兩倍稀釋，剪切力控制在4000s-1，跨膜壓TMP控制在5～10psi，將抗原液濃縮至原體積，棄透過液，收獲截留液即為純化濃縮的豬肺炎支原體滅活抗原。以下通過BCA法測定純化前后總蛋白含量，并以此計算蛋白去除率，實驗結果如表7所示。通過雙抗體夾心Elisa法測定純化前后抗原回收率，實驗結果如表8所示。通過豬血清白蛋白殘留試劑盒測定純化前后豬血清殘余量，實驗結果如表9所示。表7以BCA法檢測的純化前后總蛋白含量及相對應的蛋白去除率表8以雙抗體夾心Elisa法檢測的純化前后抗原回收率表9以豬血清白蛋白殘留試劑盒檢測的純化前后豬血清殘余量樣品名稱濃度ug/ml體積ml質量mg豬血清去除率原液315.920063.18-濃縮后152.5406.190.3％實施例5純化前后效力檢驗體重1.5～2.0kg健康家兔(豬肺炎支原體血清抗體IHA效價不高于1:5)15只，其中5只各后腿肌肉注射實施例4純化前滅活抗原0.5ml，5只后腿肌肉注射實施例4純化后滅活抗原0.5ml，注射后14日，相同途徑、相同劑量二免。剩余5只不接種作為對照。二免后30日，連同對照組采血，用IHA法檢測家兔血清豬肺炎支原體抗體效價。效力檢測結果如表10所示：表10豬肺炎支原體抗原純化前、后對免疫接種后抗體效價的影響實施例6一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養液，澄清處理，收集產物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產物用緩沖液進行3倍體積洗濾后，收集產物。在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：步驟1)所述豬肺炎支原體抗原培養液中所含有的抗原是豬肺炎支原體活抗原或滅活的豬肺炎支原體抗原。步驟1)所述澄清處理是利用濾膜、膜包或中空纖維超濾膜實現的。步驟2)所述超濾濃縮是利用中空纖維膜過濾系統實現的。所述中空纖維膜過濾系統中中空纖維柱孔徑為300KD。步驟2)超濾濃縮的倍數是2倍體積。步驟2)所述超濾濃縮過程中，剪切速率為2000sec-1。步驟2)所述超濾濃縮過程中，跨膜壓為5psi。步驟3)所述的緩沖液是pH值為7.2的PBS溶液。步驟3)所述洗濾是等體積洗濾。實施例7一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養液，澄清處理，收集產物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產物用緩沖液進行7倍體積洗濾后，收集產物。在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：所述中空纖維膜過濾系統中中空纖維柱孔徑為700KD。步驟2)超濾濃縮的倍數是5倍體積。步驟2)所述超濾濃縮過程中，剪切速率為6000sec-1。步驟2)所述超濾濃縮過程中，跨膜壓為10psi。步驟3)所述的緩沖液是pH值為7.4的PBS溶液。實施例7一種純化豬肺炎支原體的方法，包括以下步驟：1)取豬肺炎支原體抗原培養液，澄清處理，收集產物即為澄清抗原液；2)將步驟1)得到的澄清抗原液進行超濾濃縮：3)將步驟2)所得產物用緩沖液進行5倍體積洗濾后，收集產物。以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3