本發明涉及生物細胞領域，涉及一種克隆細胞的培養方法。
背景技術：
細胞克隆是生物繁殖一種類型，無性繁殖。是一種把單個細胞從群體內分離出來單獨培養，使之重新繁衍成一個新的細胞群體的培養技術。克隆能夠保持親本的絕大部分性狀。生物體通過無性繁殖所生成的群體或個體稱為克隆體，由動物體內一個細胞經過無性生殖過程進而發育形成的動物個體為克隆動物。克隆細胞的培養至關重要，因此需要研究一種新的方法。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明提供一種解決或部分解決上述問題的一種克隆細胞的培養方法。
為達到上述技術方案的效果，本發明的技術方案為：一種克隆細胞的培養方法，其特征在于，包含以下步驟：
取48份克隆細胞用ELISA試劑盒檢測p27抗原，將其中p27抗原檢測結果為陽性提取出來，從p27抗原檢測結果為陽性的克隆細胞隨機抽選6份，并且1500rpm離心5分鐘，接著接于長成60％單層CEF的24孔板中，培養8d后將細胞傳入含飛片的六孔板中繼續培養3d，無菌取出六孔板中的飛片，用固定液固定，所述固定液為丙酮與已醇以3：2的比例混合，并且加入青霉素100ul/ml、鏈霉素80ul/ml進行無菌培養。
本發明的有益成果是：本發明通過科學的方法對克隆細胞進行培養，首先對樣本進行抽樣，采用隨機抽取的方式從其中抽取p27抗原檢測結果為陽性的克隆細胞，嚴格地指定步驟，具有科學、嚴謹的優點。
具體實施方式
為了使本發明所要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行詳細的說明。應當說明的是，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明，能實現同樣功能的產品屬于等同替換和改進，均包含在本發明的保護范圍之內。具體方法如下：
實施例1：體外培養的生物成分無外乎兩種結構形式：其一是小塊組織或稱為組織塊(tissue block)，一般稱為外植塊；其二是將生物組織分散后制成的單個細胞，一般稱為分離的細胞(isolated cell)或者分散的細胞(dissociated cell)。
分散的過程通常在培養液或平衡鹽溶液中進行，分散的細胞被懸浮于培養液或平衡鹽溶液中。單個細胞分散存在于培養液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱為細胞懸液(cell suspension)。
狹義的細胞培養(cell culture)主要是指分離(散)細胞培養，廣義的細胞培養的概念還包括單(個)細胞培養(single cell culture)。一種是群體培養(mass culture)，將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合(confluence)后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培養(clonal culture)，將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆(clone)。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。
現今，用于疫苗生產的細胞基本有3類，即原代細胞、二倍體細胞株及傳代細胞系。經過幾十年的研究和發展，目前我國已經擁有了可以進行大規模疫苗生產的動物原代細胞、二倍體細胞和Vero細胞等生產技術，用于生產多種人用、動物疫苗。其中二倍體細胞(如我國70年代建立的人胚肺二倍體細胞株KMB17和2BS)對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞時在其培養物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，是當前病毒性疫苗生產較為理想的細胞基質。Vero細胞是1962年由日本Chiba大學的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴性成纖維細胞，核型為2n 60，高倍體率約為1.7％，可持續地進行培養，不含任何污染因子。通常使用199培養基添加5％胎牛血清進行培養。該細胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準廣泛用于人用、動物用疫苗生產。
實施例2：
體內細胞生長在動態平衡環境中，而組織培養細胞的生存環境是培養瓶、皿或其它容器，生存空間和營養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養液，否則將影響細胞的繼續生存，這一過程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外，很多細胞在體外的生存也不是無限的，存在著一個發展過程。所有這一切，使組織細胞在培養中有著一系列與體內不同的生存特點。
(一)培養細胞生命期(Life Span of Culture Cells):所謂培養細胞生命期，是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細胞培養，在不凍存和反復傳代條件下，可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；如培養的為其它細胞,如肝細胞或腎細胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉化時，細胞的生存期才可能發生改變。正常細胞培養時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞全生存過程中，大致都經歷以下三個階段：
1、原代培養(Primary Culture)期：也稱初代培養，即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段，一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的(Heterogeneous)，也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。
2、傳代期：初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續時間最長。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。
3、衰退期：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，最后衰退凋亡。
在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點(多發生在傳代末或衰退期)，由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化(Spontaneous Transformation)。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系(Infinite CellLine)，也稱連續細胞系(Continuous Cell Line)。無限細胞系的形成主要發生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
(二)組織培養細胞一代生存期所有體外培養細胞，包括初代培養及各種細胞系，當生長達到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下，細胞數量增加與飽和速度相對要快(實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比稀少時要快)。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快，培養液中血清含量多時細胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
所謂細胞“一代”一詞，系僅指從細胞接種到分離再培養時的一段時間，這已成為培養工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世(Generation)或倍增〔Doubling〕不同；在細胞一代中，細胞能倍增3～6次。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，并非用以限定本發明的權利要求保護范圍。同時以上說明，對于相關技術領域的技術人員應可以理解及實施，因此其他基于本發明所揭示內容所完成的等同改變，均應包含在本權利要求書的涵蓋范圍內。
本發明的有益成果是：本發明通過科學的方法對克隆細胞進行培養，首先對樣本進行抽樣，采用隨機抽取的方式從其中抽取p27抗原檢測結果為陽性的克隆細胞，嚴格地指定步驟，具有科學、嚴謹的優點。