本發(fā)明涉及一種小分子三七多糖提取物的制備方法及應(yīng)用，屬于植物活性物質(zhì)提取分離領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在植物糖化學(xué)研究中很多報(bào)道指出具有治病、防病功效的高活性多糖基本為小分子多糖，大分子多糖功效較弱。免疫系統(tǒng)是一個(gè)極其復(fù)雜而重要的生理體系，其中吞噬細(xì)胞是機(jī)體抵抗病原微生物感染的第一道防線之一，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們都是先天性免疫系統(tǒng)的重要組分。其中巨噬細(xì)胞能夠非特異性吞噬和殺滅病原微生物，同時(shí)還能夠釋放一些炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子來將其殺滅，此外還能將病原菌提供給T淋巴細(xì)胞，激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)釋放各種細(xì)胞因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖(PSG)能通過NF～κB信號(hào)通路促進(jìn)免疫細(xì)胞的成熟分化，及細(xì)胞因子TNF～α、IL～1β、IL～12，共刺激分子CD40、CD80、CD86的表達(dá)，從而在機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
三七又名金不換，為五加科植物，以其根部作為藥用部分，三七主產(chǎn)于我國(guó)的云南文山，三七多糖是從三七中提取出來的具有多種生物活性且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖或其復(fù)合物。大量研究證明，三七多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等多種功效。我國(guó)目前對(duì)三七多糖的開發(fā)利用并不多，三七多糖的功效研究、產(chǎn)品開發(fā)等還存在著很大的研究?jī)r(jià)值和空間。
具有活性的三七小分子多糖的提取方法未見報(bào)道，相關(guān)報(bào)道主要集中在三七總多糖提取方法和藥理活性研究方面；三七總多糖提取主要有采用干藥材粉碎、脫脂、水提、乙醇沉淀法、脫蛋白、干燥得到三七總多糖，但由于提取的大分子多糖含有可溶性纖維素、淀粉等，藥效活性很低，且大部分大分子多糖分子量都是幾萬萬、上百萬，人體很難吸收，人體要真正吸收發(fā)揮作用要通過代謝成小分子成分，所以大分子多糖的利用低。
因此，開展了對(duì)三七小分子多糖的研究，可為進(jìn)一步深入研究我國(guó)特有三七資源、提高其附加值、增加種植戶收入做出積極貢獻(xiàn)，具有較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，也可給人們提供新的保健品，為人類健康做出貢獻(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供小分子三七多糖提取物的制備方法，該方法以三七為原料，具體操作如下：
（1）在粉碎后的三七粉末中加入質(zhì)量百分比濃度95～100%乙醇溶液提取處理2～3h ，過濾濾渣重復(fù)提取1～2次，丟棄濾液；
（2）在步驟（1）濾渣中加入水并于90～95℃下提取1～2次，提取時(shí)間1.5～2小時(shí)后過濾合并濾液，丟棄濾渣；
（3）將步驟（2）濾液置于40～60℃下真空濃縮到波美度1.1后，加入高濃度乙醇溶液使得混合液中乙醇濃度為93%～97%，靜置3～5h小時(shí)后，過濾收集沉淀；
（4）在步驟（3）的沉淀中加入其質(zhì)量10～15倍的純凈水混勻，然后加入混合物質(zhì)量3～5%的三氟乙酸，于90～100℃密閉水解20～40min后，40～60℃下真空回收三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
或在步驟（3）的沉淀中加入其質(zhì)量10～15倍的純凈水混勻，然后加入混合物質(zhì)量2%的溶菌酶，于35℃～45℃水解3～5小時(shí)后，升溫至100℃滅酶10min得小分子多糖粗提液；
（5）將步驟（4）小分子多糖粗提液過磺酸基強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂柱，收集流出液體；
（6）將步驟（5）收集的液體過丙烯酸弱堿性陰離子交換樹脂柱，收集流出液體；
（7）在步驟（6）收集的液體中加入液體質(zhì)量1～2%的活性炭粉，混勻后60～65℃下靜置0.5h后，用鈦棒過濾器過濾得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）將步驟（7）小分子三七多糖溶液濃縮、冷凍干燥后即得小分子三七多糖提取物。
所述步驟（1）中添加的乙醇溶液量是三七粉末質(zhì)量4～6倍。
所述步驟（2）中添加的水量為濾渣質(zhì)量6～10倍。
所述鈦棒過濾器的濾芯過濾精度為0.25～0.5微米。
本發(fā)明另一目的是將上述方法制得的小分子三七多糖應(yīng)用于制備治療免疫缺陷或免疫力低下疾病藥物中，即制備治療免疫疾病藥物。
本發(fā)明所述應(yīng)用中還可以加入一種或多種藥物上可接受的輔料，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的填充劑、稀釋劑、粘合劑、賦形劑、吸收促進(jìn)劑、填充劑、表面活性劑和穩(wěn)定劑等，必要時(shí)還可加入香味劑、色素和甜味劑等；或者與其他治療免疫疾病的藥物配合使用。
本發(fā)明所述應(yīng)用除制成膠囊外，還可以制成丸劑、粉劑、片劑、粒劑、口服液和注射液等多種形式。
本發(fā)明方法粗提取采用乙醇脫脂、水提、乙醇沉淀去除大部分蛋白質(zhì)、果膠、粘液質(zhì)、淀粉等雜質(zhì)；然后采用三氟乙酸或溶菌酶水解控制水解反應(yīng)進(jìn)程，使得大分子多糖向小分子多糖方向水解轉(zhuǎn)化，盡可能不轉(zhuǎn)化為單糖，比傳統(tǒng)酸水解、酶水解反應(yīng)更為溫和可控，小分子多糖收率更高；使用陰陽(yáng)離子交換柱脫去液體中氨基酸、蛋白質(zhì)、色素、灰分，替代傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑脫蛋白工藝，解決傳統(tǒng)方法中所得多糖灰分超標(biāo)這一問題，具有更好的工業(yè)化操作性；液體冷凍干燥所得產(chǎn)物，避免熱風(fēng)干燥造成小分子多糖成分化學(xué)性質(zhì)改變，提取物經(jīng)檢測(cè)蛋白質(zhì)、淀粉殘留極低，本工藝操作簡(jiǎn)單，成本低，產(chǎn)業(yè)化程度高。
本發(fā)明采用三七為原料進(jìn)行提取制備，所得三七小分子多糖收率高、純度高、色白；常規(guī)的多糖糖酸水解采用鹽酸、硫酸、酶水解等所得產(chǎn)物大部分為單糖，徹底失去其多糖活性，采用三氟乙酸進(jìn)行多糖分子切割或溶菌酶水解，反應(yīng)較為溫和所得產(chǎn)物為小分子多糖，其水解試劑溶液去除不帶殘留，不影響產(chǎn)品質(zhì)量。
本發(fā)明所得提取物中蛋白質(zhì)、淀粉、灰分、重金屬脫除較為徹底，多糖藥理活性較高；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明所得提取物與三七總多糖對(duì)照組比較，在細(xì)胞增殖效應(yīng)免疫試驗(yàn)和細(xì)胞吞噬效應(yīng)免疫試驗(yàn)中免疫增強(qiáng)均有顯著性差異，說明小分子三七多糖提取物比三七總多糖提取物更能促進(jìn)免疫力提高，具有治療免疫疾病的應(yīng)用前景，且制備方法適于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。
實(shí)施例1：小分子三七多糖提取物的制備方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其質(zhì)量5倍的質(zhì)量百分比濃度95%乙醇溶液提取3h，過濾濾渣重復(fù)提取2次，丟棄濾液得藥渣；
（2）在步驟（1）藥渣中加入藥渣質(zhì)量8倍的水并于90～93℃下提取2次，提取時(shí)間2小時(shí)后過濾得濾液，丟棄藥渣；
（3）將步驟（2）濾液置于40℃下真空濃縮到波美度1.1后，加入無水乙醇，使得混合液中乙醇濃度為93%，靜置3小時(shí)，過濾得沉淀；
（4）將步驟（3）中沉淀用其質(zhì)量12倍的純凈水溶解，然后加入混合液質(zhì)量4%的三氟乙酸于100℃密閉水解20min后，60℃下真空回收液體中三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
（5）將步驟（4）小分子多糖粗提液過磺酸基強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂(001X10)柱，收集流出液體；
（6）將步驟（5）收集的液體過丙烯酸弱堿性陰離子交換樹脂(D202)柱，收集無色流出液；
（7）步驟（6）收集的液體加入液體重量2%的活性炭粉末，混勻后60℃下浸泡半小時(shí)后，鈦棒過濾器（濾蕊過濾精度0.5微米）過濾得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）將步驟（7）小分三七多糖溶液濃縮到原體積1/3后，冷凍干燥得活性小分子三七多糖提取物31g，多糖含量87%，灰分2ppm，含氮量未檢出。
實(shí)施例2：小分子三七多糖提取物的制備方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其質(zhì)量4倍的無水乙醇提取2h，過濾濾渣重復(fù)提取1次，丟棄濾液得藥渣；
（2）在步驟（1）藥渣中加入藥渣質(zhì)量7倍的水并于90-93℃下提取2次，提取時(shí)間1.5小時(shí)后過濾得濾液，丟棄藥渣；
（3）將步驟（2）濾液置于50℃下真空濃縮到波美度1.1后，加入無水乙醇，使得混合液中乙醇濃度為97%，靜置4小時(shí)，過濾得沉淀；
（4）在步驟（3）的沉淀加入其質(zhì)量10倍的純凈水溶解，然后加入混合物質(zhì)量2%溶菌酶，于35℃水解5小時(shí)后，升溫至100℃滅酶10分鐘得小分子多糖粗提液；
（5）將步驟（4）小分子多糖粗提液過磺酸基強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂(001X4)柱，收集流出液體；
（6）將步驟（5）收集的液體過丙烯酸弱堿性陰離子交換樹脂(D941)柱，收集無色流出液；
（7）步驟（6）收集的液體加入液體重量1%的活性炭粉末，混勻后60℃下浸泡半小時(shí)后用鈦棒過濾器（濾蕊0.3微米）過濾得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）將步驟（7）小分子三七多糖溶液濃縮到原體積1/3后，冷凍干燥得小分子三七多糖提取物24克，多糖含量88%，灰分2ppm，含氮量未檢出。
實(shí)施例3：小分子三七多糖提取物的制備方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其質(zhì)量4倍的無水乙醇提取2h，過濾濾渣重復(fù)提取1次，丟棄濾液得藥渣；
（2）在步驟（1）藥渣中加入藥渣質(zhì)量6倍的水并于90～95℃下提取1次，提取時(shí)間1.5小時(shí)后過濾得濾液，丟棄藥渣；
（3）將步驟（2）濾液置于50℃下真空濃縮到波美度1.1后，加入無水乙醇，使得混合液中乙醇濃度為97%，靜置4小時(shí)，過濾得沉淀；
（4）將步驟（3）中沉淀用其質(zhì)量10倍的純凈水溶解，然后加入混合液質(zhì)量3%的三氟乙酸于90℃密閉水解30min后，50℃下真空回收液體中三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
（5）將步驟（4）小分子多糖粗提液過磺酸基強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂(001X4)柱，收集流出液體；
（6）將步驟（5）收集的液體過丙烯酸弱堿性陰離子交換樹脂(D941)柱，收集無色流出液；
（7）步驟（6）收集的液體加入液體重量1%的活性炭粉末，混勻后60℃下浸泡半小時(shí)后，鈦棒過濾器（濾蕊過濾精度0.25微米）過濾得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）將步驟（7）小分三七多糖溶液濃縮到過濾后體積積1/3后，冷凍干燥得活性小分子三七多糖提取物25g，多糖含量84%，灰分2ppm，含氮量未檢出。
采用MTT法檢測(cè)本實(shí)施例3提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖效應(yīng)：
1、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自上海細(xì)胞所，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中（含100 mg·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素），置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每天換液，隔2天傳代1次；
2、藥品的制備：小分子三七多糖提取物溶于一定量細(xì)胞培養(yǎng)液中，使得溶液中三七多糖終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL，過濾（0.22μm濾膜）除菌，-20℃分裝保存；
3、實(shí)驗(yàn)方法
MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3 - ( 4,5 ) - dimethylthiahiazo ( - z - y1 ) - 3,5 – di – phenytetrazoliumromide，MTT四甲基偶氮唑鹽為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下四唑環(huán)開裂，生成藍(lán)色的甲臜結(jié)晶，甲臜結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）；還原生成的甲臜結(jié)晶可在DMSO溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。
4、分析方法：調(diào)節(jié)RAW264.7細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，每孔加入細(xì)胞懸浮液100μL，培養(yǎng)4小時(shí)后洗去未貼壁細(xì)胞，然后分別加入不同濃度的小分子三七多糖、三七總多糖（終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL），同時(shí)設(shè)置1 μg/mL的LPS，空白對(duì)照孔；每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔；5%CO2，37℃孵育24小時(shí)，倒置顯微鏡觀察，加入含5% MTT的培養(yǎng)液20μL，4小時(shí)后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲亞砜震蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。
細(xì)胞相對(duì)增殖率=（實(shí)驗(yàn)組吸光值-對(duì)照組吸光值）/對(duì)照組吸光值×100%；
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1：
表1：本實(shí)施例小分子三七多糖提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖影響
；
6、結(jié)論
MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論三七總多糖、小分子三七多糖提取物、不同劑量（5，10，20，40，80，160 μg/mL）作用RAW264.7細(xì)胞24h后均可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨著劑量的增加，增殖率逐漸升高，達(dá)到最高點(diǎn)（40 mg·L-1）后增殖率逐漸下降，但仍表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，說明小分子三七多糖提取物無細(xì)胞毒作用；比較低濃度的三七總多糖，小分子三七多糖提取物具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果，尤其是低濃度組明顯優(yōu)于總多糖。
實(shí)施例4：小分子三七多糖提取物的制備方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其質(zhì)量5倍的質(zhì)量百分比濃度95%乙醇溶液提取3h，過濾濾渣重復(fù)提取2次，丟棄濾液得藥渣；
（2）在步驟（1）藥渣中加入藥渣質(zhì)量8倍的水并于90～93℃下提取2次，提取時(shí)間2小時(shí)后過濾得濾液，丟棄藥渣；
（3）將步驟（2）濾液置于40℃下真空濃縮到波美度1.1后，加入無水乙醇，使得混合液中乙醇濃度為93%，靜置3小時(shí)，過濾得沉淀；
（4）將步驟（3）中沉淀用其質(zhì)量12倍的純凈水溶解，然后加入混合液質(zhì)量4%的三氟乙酸于100℃密閉水解20min后，60℃下真空回收液體中三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
（5）將步驟（4）小分子多糖粗提液過磺酸基強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂(001X10)柱，收集流出液體；
（6）將步驟（5）收集的液體過丙烯酸弱堿性陰離子交換樹脂(D202)柱，收集無色流出液；
（7）步驟（6）收集的液體加入液體重量2%的活性炭粉末，混勻后60℃下浸泡半小時(shí)后，鈦棒過濾器（濾蕊過濾精度0.4微米）過濾得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）將步驟（7）小分三七多糖溶液濃縮到過濾后體積1/3，冷凍干燥得活性小分子三七多糖提取物30g，多糖含量89%，灰分1ppm，含氮量未檢出。
采用中性紅法檢測(cè)實(shí)施例4小分子三七多糖提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的吞噬效應(yīng)；
1、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自上海細(xì)胞所，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中（含100 mg·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素），置于37℃，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每天換液，隔2天傳代1次；
2、藥品的制備：小分子三七多糖提取物溶于一定量細(xì)胞培養(yǎng)液中，使得三七多糖多糖終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL，過濾（0.22μm濾膜）除菌，-20℃分裝保存；
3、實(shí)驗(yàn)方法：
正常情況下，巨噬細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，被激活后吞噬活性增加，可以通過檢測(cè)期吞噬活性來衡量其免疫活性的增加。靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞受到刺激后，吞噬功能增強(qiáng)，吞噬活性的大小反映了藥物的藥理活性。中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能是通過巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬量來反映巨噬細(xì)胞的吞噬能力，是快速篩選巨噬細(xì)胞吞噬功能調(diào)節(jié)成分的常用細(xì)胞模型。
4、分析方法：三七總多糖、小分子三七多糖提取物（終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/mL）作用于終濃度為106 /mL RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)置1 μg/mL的LPS，空白對(duì)照孔。棄上清，加入0.1%中性紅（100 mg中性紅/100 mL生理鹽水）溶液100 μL /孔，培養(yǎng)3小時(shí)后以溫PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液（醋酸：乙醇=1：1）200 μL/孔，靜置30 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬的中性紅，以A540值表示，計(jì)算吞噬指數(shù)。
吞噬指數(shù)=（實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值-1）×100%；
5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2：
巨噬細(xì)胞在機(jī)體特異性免疫、非特異性免疫中發(fā)揮著重要而不可缺少的作用，對(duì)侵入機(jī)體的異物及衰老死亡的細(xì)胞具有吞噬功能，也是機(jī)體抗腫瘤的第一道防線，而且吞噬能力作為檢測(cè)巨噬細(xì)胞功能的重要指標(biāo)。為了檢測(cè)在三七多糖是否可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，因此在體外測(cè)定了三七多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。
表2：三七多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖影響
；
6、結(jié)論：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論三七總多糖、小分子三七多糖提取物（5，10，20，40，80，160 μg/mL）處理RAW264.7巨噬細(xì)胞24h后，都能促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞活化，顯著提高吞噬中性紅的能力，并且隨著藥物濃度的增加，巨噬細(xì)胞的吞噬能力也顯著增加，高濃度時(shí)促進(jìn)活性逐漸下降?？v向比較發(fā)現(xiàn)：總多糖和小分子三七多糖提取物（57.34%＞小分子純多糖54.76%＞三七總多糖53.96%），這表明小分子三七多糖能夠刺激巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，成為活化的巨噬細(xì)胞，并使其吞噬能力得到顯著增強(qiáng)。