本發(fā)明涉及一種多糖提取方法，具體涉及新疆一枝蒿多糖提取方法，屬于生物醫(yī)藥領域。
背景技術：
多糖(Polysaccharide，PS)是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵聚合而成的大分子，廣泛存在于動、植物和微生物中。多糖作為一種重要的生命物質，具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖等多種生物活性?，F(xiàn)如今己有不少研究結果表明，糖類作為信息分子在受精、發(fā)生、發(fā)育分化，神經(jīng)系統(tǒng)的維持等方面起著重要作用。另外，炎癥和自身免疫疾病、老化、癌細胞的異常增殖和轉換，細胞識別和病原體感染等生物學過程中也都有糖類的介導。
新疆一枝蒿為菊科蒿屬的一種多年生草本植物，味苦，性寒，是維吾爾族傳統(tǒng)藥材，具有驅風活血、清熱解毒、散瘀消腫、健胃消食、抗過敏、抗腫瘤、止吐、止血、解蛇毒等多重功效。臨床上用于治療感冒發(fā)燒、肝炎、消化不良、蕁麻疹、過敏性疾病等。維吾爾語稱之為“一孜乎艾曼尼”。
新疆一枝蒿化學成分主要包括黃酮類、倍半萜類、多糖等物質。徐鑫等(新疆一枝蒿多糖的體外抗氧化性研究，食品科技，2011年第36卷第12期)研究表明，新疆一枝蒿多糖含量高，具有抗氧化、抗衰老活性。因此優(yōu)化新疆一枝蒿多糖的提取工藝，對于新疆一枝蒿植物資源的綜合利用具有重要的意義。
現(xiàn)有的新疆一枝蒿多糖提取工藝有水煮法、微波輔助法，均存在提取率低、工藝復雜、成本高、不適合工業(yè)化大生產(chǎn)等缺陷。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種提取率高、工藝簡單、成本低、適合工業(yè)化大生產(chǎn)的新疆一枝蒿多糖超聲波輔助提取工藝。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種新疆一枝蒿多糖提取方法，包括以下步驟：
(1)取新疆一枝蒿，置于濃度為75-100％(優(yōu)選85-98％，最優(yōu)選95％)的乙醇中，熱水浴下回流，晾干。該步驟可以除去脂類、低聚糖、單糖和色素。
(2)取步驟(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，置于水中，利用超聲波輔助提取新疆一枝蒿多糖，將提取液過濾后濃縮。
(3)取步驟(2)中濃縮后的提取液，加入濃度為75-100％(優(yōu)選85-98％，最優(yōu)選95％)的乙醇，進行醇沉，取沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。此時得到的新疆一枝蒿多糖為粗品。
在優(yōu)選的技術方案中，本發(fā)明的提取方法進一步包括步驟(4)利用動態(tài)大孔吸附樹脂法進行純化以脫蛋白，得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。
在優(yōu)選的實施方案中，步驟(1)中，回流2-5次，更優(yōu)選2-3次，最優(yōu)選2次；每次0.5-5h，更優(yōu)選每次1-3h，最優(yōu)選每次2h；料液比為1:2-1:7(g:mL)，更優(yōu)選為1:3-1:5(g:mL)，最優(yōu)選為1:4(g:mL)。
在優(yōu)選的實施方案中，步驟(2)中，粉碎的新疆一枝蒿過40-60目篩，更優(yōu)選過40-50目篩，最優(yōu)選過40目篩；料液比為1:10-1:50(g:mL)，更優(yōu)選為1:20-1:40(g:mL)，最優(yōu)選為1:30(g:mL)；提取溫度為40-80℃，更優(yōu)選為60-80℃，最優(yōu)選為72℃；提取時間為1-5h，更優(yōu)選為2-3h，最優(yōu)選為2.5h；超聲波功率為200-500W，更優(yōu)選為300-400W，最優(yōu)選為350W；在水浴下濃縮，進一步優(yōu)選水浴溫度為70-90℃，更優(yōu)選75-85℃，最優(yōu)選為80℃。
在優(yōu)選的實施方案中，步驟(3)中，濃縮后的提取液和乙醇的體積比為1:3-1:5，更優(yōu)選為1:4-1:5，最優(yōu)選為1:4；醇沉時間為4-24h，更優(yōu)選為8-16h，最優(yōu)選為12h；醇沉后離心獲得沉淀物，更優(yōu)選3000-4500r/min離心5-15min，最優(yōu)選4000r/min離心10min。
在優(yōu)選的實施方案中，步驟(4)中樹脂為HPD-300樹脂、LS-46D樹脂或HP-600樹脂；優(yōu)選，按濕法裝柱，加入濃度為1.5-4.0％(優(yōu)選2.0-3.0％，最優(yōu)選3.0％)的新疆一枝蒿多糖水溶液，用蒸餾水洗脫，收集后得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。在進一步優(yōu)選的實施方案中，步驟(4)中，新疆一枝蒿多糖溶液的流速為0.5-2.5mL/min，更優(yōu)選為0.8-2.0mL/min，最優(yōu)選為1.0mL/min；蒸餾水的流速為0.2-2.0mL/min，更優(yōu)選為0.3-1.5mL/min，最優(yōu)選為0.5mL/min。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還涉及根據(jù)上述提取方法提取得到的新疆一枝蒿多糖。本發(fā)明的新疆一枝蒿多糖可用于制備抗衰老的保健品和藥品。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是新疆一枝蒿多糖粗品的提取率至少為3.11％，較傳統(tǒng)水煮法提取工藝多糖提取率(1.67％)提高1.64％。且本發(fā)明成本低，提取條件準確可靠，工藝流程簡單，可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明制備得到的新疆一枝蒿多糖粗品在濃度為2.5mg/mL時對羥自由基和DPPH的清除作用均高于60％。本發(fā)明純化多糖粗品的方法，多糖得率至少為77.9％，而利用靜態(tài)大孔吸附樹脂法脫蛋白法純化多糖粗品的方法，多糖得率僅為51.7％，利用酶法—Sevage法聯(lián)合脫蛋白法純化多糖粗品的方法，多糖得率僅為50.5％。
下面通過說明書附圖和具體實施方式對本發(fā)明做進一步介紹。
附圖說明
圖1本發(fā)明的新疆一枝蒿多糖粗品清除羥自由基和DPPH的活性
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應理解，在閱讀了本發(fā)明所記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。
實施例1
(1)取新疆一枝蒿，置于濃度為95％的乙醇中，料液比為1:4(g:mL)，熱水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)將步驟(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，過40目篩，置于水中，利用超聲波輔助提取新疆一枝蒿多糖，料液比為1:30(g:mL)，提取溫度為72℃，提取時間為2.5h，超聲波功率為350W，將提取液過濾后，80℃水浴濃縮。
(3)取步驟(2)中濃縮后的提取液，加入4倍提取液體積的濃度為95％的乙醇進行醇沉，醇沉時間為12h，4000r/min離心10min，獲得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300動態(tài)大孔吸附樹脂法脫蛋白：濕法裝柱，加入濃度為3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速為1.0mL/min)，用蒸餾水洗脫(流速為0.5mL/min)，收集后得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本實施例中，多糖粗品提取率為3.11％，純化多糖粗品的方法多糖得率為79.6％。
其中多糖粗品提取率的計算方法為：
新疆一支蒿多糖粗品提取率(％)＝多糖粗品質量/原料質量×100％
純化多糖方法的多糖得率的計算方法為：
新疆一支蒿純化多糖得率(％)＝脫去游離蛋白的多糖質量/多糖粗品質量×100％
實施例2
(1)取新疆一枝蒿，置于濃度為95％的乙醇中，料液比為1:4(g:mL)，熱水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)將步驟(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，過40目篩，置于水中，利用超聲波輔助提取新疆一枝蒿多糖，料液比為1:20(g:mL)，提取溫度為70℃，提取時間為2.5h，超聲波功率為350W，將提取液過濾后，80℃水浴濃縮。
(3)取步驟(2)中濃縮后的提取液，加入4倍提取液體積的濃度為95％的乙醇進行醇沉，醇沉時間為12h，4000r/min離心10min，獲得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300動態(tài)大孔吸附樹脂法脫蛋白：濕法裝柱，加入濃度為3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速為1.0mL/min)，用蒸餾水洗脫(流速為0.5mL/min)，收集后得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本實施例中，多糖粗品提取率為3.43％，純化多糖粗品的方法多糖得率為78.5％。
實施例3
(1)取新疆一枝蒿，置于濃度為95％的乙醇中，料液比為1:5(g:mL)，熱水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)將步驟(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，過40目篩，置于水中，利用超聲波輔助提取新疆一枝蒿多糖，料液比為1:10(g:mL)，提取溫度為80℃，提取時間為2.5h，超聲波功率為350W，將提取液過濾后，80℃水浴濃縮。
(3)取步驟(2)中濃縮后的提取液，加入4倍提取液體積的濃度為95％的乙醇進行醇沉，醇沉時間為12h，4000r/min離心10min，獲得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300動態(tài)大孔吸附樹脂法脫蛋白：濕法裝柱，加入濃度為2.5％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速為1.0mL/min)，用蒸餾水洗脫(流速為0.5mL/min)，收集后得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本實施例中，多糖粗品提取率為3.41％，純化多糖粗品的方法多糖得率為78.0％。
實施例4
(1)取新疆一枝蒿，置于濃度為95％的乙醇中，料液比為1:3(g:mL)，熱水浴下回流2次，每次2.5h，晾干。
(2)將步驟(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，過40目篩，置于水中，利用超聲波輔助提取新疆一枝蒿多糖，料液比為1:30(g:mL)，提取溫度為60℃，提取時間為3.0h，超聲波功率為350W，將提取液過濾后，80℃水浴濃縮。
(3)取步驟(2)中濃縮后的提取液，加入4倍提取液體積的濃度為95％的乙醇進行醇沉，醇沉時間為12h，4000r/min離心10min，獲得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300動態(tài)大孔吸附樹脂法脫蛋白：濕法裝柱，加入濃度為3.5％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速為1.0mL/min)，用蒸餾水洗脫(流速為0.5mL/min)，收集后得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本實施例中，多糖粗品提取率為3.52％，純化多糖粗品的方法多糖得率為77.9％。
實施例5
(1)取新疆一枝蒿，置于濃度為95％的乙醇中，料液比為1:4(g:mL)，熱水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)將步驟(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，過40目篩，置于水中，利用超聲波輔助提取新疆一枝蒿多糖，料液比為1:30(g:mL)，提取溫度為80℃，提取時間為2.0h，超聲波功率為300W，將提取液過濾后，80℃水浴濃縮。
(3)取步驟(2)中濃縮后的提取液，加入4倍提取液體積的濃度為95％的乙醇進行醇沉，醇沉時間為12h，4000r/min離心10min，獲得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300動態(tài)大孔吸附樹脂法脫蛋白：濕法裝柱，加入濃度為3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速為1.0mL/min)，用蒸餾水洗脫(流速為0.5mL/min)，收集后得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本實施例中，多糖粗品提取率為3.45％，純化多糖粗品的方法多糖得率為78.4％。
實施例6
(1)取新疆一枝蒿，置于濃度為95％的乙醇中，料液比為1:4(g:mL)，熱水浴下回流2次，每次2h，晾干。
(2)將步驟(1)中晾干的新疆一枝蒿粉碎，過40目篩，置于水中，利用超聲波輔助提取新疆一枝蒿多糖，料液比為1:30(g:mL)，提取溫度為70℃，提取時間為2.5h，超聲波功率為400W，將提取液過濾后，80℃水浴濃縮。
(3)取步驟(2)中濃縮后的提取液，加入4倍提取液體積的濃度為95％的乙醇進行醇沉，醇沉時間為12h，4000r/min離心10min，獲得沉淀物，干燥得新疆一枝蒿多糖。
(4)利用HPD-300動態(tài)大孔吸附樹脂法脫蛋白：濕法裝柱，加入濃度為3.0％的新疆一枝蒿多糖溶液(流速為1.0mL/min)，用蒸餾水洗脫(流速為0.5mL/min)，收集后得脫去游離蛋白的新疆一枝蒿多糖。
本實施例中，多糖粗品提取率為3.47％，純化多糖粗品的方法多糖得率為78.8％。
實施例7
1.新疆一枝蒿多糖粗品清除DPPH自由基活性的測定
配制質量濃度分別為0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL的新疆一枝蒿多糖粗品溶液，向96孔微量滴定板中各加入50μL不同濃度多糖粗品溶液和50μL 120μmol/L的DPPH溶液，避光反應半小時后，在517nm處測吸光度值為As，每個樣品做3個平行試驗。計算DPPH自由基清除率公式如下：
清除率(％)＝[1-(As-Ar)/Ao]×100
按照上述方法，以Vc(抗壞血酸)作為陽性對照進行測定。
式中：As為DPPH與多糖粗品溶液反應的吸光度；Ar為DPPH空白(50μL多糖粗品溶液+50μL 95％乙醇)的吸光度；Ao為未加多糖空白溶液(50μLDPPH+50μL 95％乙醇)的吸光度。
測定不同濃度新疆一枝蒿多糖多糖粗品溶液對DPPH的清除作用，以Vc為陽性對照，酶標儀檢測，結果見表1。
表1一枝蒿多糖粗品對DPPH的清除率
2.新疆一枝蒿多糖粗品清除羥基自由基活性的測定
用超純水分別配制濃度為0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的新疆一枝蒿多糖粗品溶液，在96孔板中依次加入15μL的水楊酸(9mmol/L)、15μL的H2O2(8.8mmol/L)、15μL的FeSO4(9mmol/L)，以及不同濃度的多糖粗品溶液75μL，反應30min(37℃)，超純水為空白對照組，3次平行重復。于510nm條件下，利用酶標儀測定各自的吸光度值A。按照上述方法，以Vc(抗壞血酸)作為對照進行測定。計算羥基自由基清除率公式如下：
清除率(％)＝(Ao-Ai)/Ao×100
式中：Ai為樣液反應的吸光度；Ao為空白對照組的吸光度。
在清除羥基自由基體系中加入不同濃度新疆一枝蒿多糖粗品溶液，以Vc為陽性對照，酶標儀檢測，結果見表2。
表2一枝蒿多糖粗品對·OH的清除率
以上，對本發(fā)明的實施方式進行了說明。但是，本發(fā)明不限定于上述實施方式。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。