本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種判斷鼻咽癌放療敏感性的分子標志物及應用。

背景技術：

肉堿棕櫚酰轉移酶CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1A)是細胞代謝途徑中參與脂肪酸β氧化的關鍵酶，定位于線粒體外膜。其生理功能是以肉堿為載體，將脂酰輔酶A轉化為脂酰肉堿和輔酶A，促進細胞漿中的脂肪酸進入線粒體基質進行β氧化分解，最終生成乙酰輔酶A，為生物合成及ATP的產生提供原料。新近研究表明，前列腺癌、膠質瘤、白血病干細胞、MYC高表達的三陰性乳腺癌以及氧化磷酸化活躍的彌散性大B細胞淋巴瘤中脂肪酸β氧化異?；罨Ｄ[瘤細胞依賴脂肪酸β氧化代謝提供的NADPH、ATP抵抗氧化應激或氧、葡萄糖缺乏等代謝應激，促進腫瘤細胞的增殖和存活。

Etomoxir(ETO)是FDA批準的CPT1靶向抑制劑，通過增加脂肪細胞對胰島素的敏感性、抑制肝細胞的糖異生而降低血糖，目前已應用于2型糖尿病的臨床治療。近年的研究表明，etomoxir在腫瘤的治療中發揮重要作用。在三陰性乳腺癌和前列腺癌中，etomoxir可以抑制裸鼠移植瘤的增殖。在急性粒細胞白血病中，etomoxir能誘導白血病細胞凋亡，增加靜息性白血病祖細胞對化療藥物阿糖胞嘧啶的敏感性。Etomoxir能抑制肝癌中干細胞的干性，增加肝癌干細胞對靶向藥物索拉菲尼的敏感性。以上研究提示，CPT1的靶向抑制劑etomoxir在腫瘤治療中具有潛在價值。

鼻咽癌是人群高發的腫瘤，放療是治療鼻咽癌的主要手段，但約20％的鼻咽癌患者仍出現局部復發或轉移的情況，并且成為患者死亡的主要原因。因此，發現鼻咽癌治療的分子靶標，研究靶向治療方法，增加腫瘤對放療的敏感性，是降低鼻咽癌患者死亡率的重要策略。

技術實現要素：

本發明的目的在于確定CPT1A可作為判斷鼻咽癌放療敏感性的分子標志物，etomoxir(ETO)作為CPT1A靶向抑制劑可應用于鼻咽癌的治療，etomoxir通過誘導鼻咽癌放療抵抗細胞凋亡，增加腫瘤細胞對放療的敏感性，提高治療效果。因此，分子標志物CPT1A可用于制備鼻咽癌放療增敏治療藥物、制備抑制鼻咽癌放療抵抗細胞脂肪酸代藥物、制備誘導鼻咽癌放療抵抗細胞凋亡藥物。分子標志物CPT1A的靶向抑制劑etomoxir可用于制備鼻咽癌放療增敏治療藥物、制備抑制鼻咽癌放療抵抗細胞脂肪酸代藥物、制備誘導鼻咽癌放療抵抗細胞凋亡藥物。

下面對本發明作進一步說明：

本發明以鼻咽癌放療抵抗細胞為主要的體外研究模型，發現CPT1A的mRNA、蛋白表達和酶活性水平在放療抵抗細胞中顯著增高。TCGA數據庫顯示CPT1A的mRNA水平增高降低頭頸部鱗癌患者的總生存期，鼻咽癌組織芯片顯示CPT1A蛋白高表達降低放射治療后鼻咽癌患者的總生存期。說明CPT1A可作為分子標志物用于評價鼻咽癌對放射治療是否敏感。

本發明發現CPT1A介導的脂肪酸β氧化在放療抵抗細胞中異?；罨?，表現為脂肪酸氧化活性增加，ATP和NADPH含量增加。Etomoxir處理鼻咽癌放療抵抗細胞，用細胞內ATP含量、NADPH含量評價etomoxir對細胞代謝的影響，用JC-1熒光染料檢測etomoxir對細胞線粒體膜電位的影響，用Annexin-V熒光染料研究etomoxir對細胞凋亡的影響。研究發現，etomoxir能抑制鼻咽癌放療抵抗細胞的ATP、NADPH含量，降低線粒體膜電位，增加細胞凋亡。

發明人以臨床常用的放療增敏劑順鉑(Cisplatin)為陽性對照，用克隆形成實驗評價etomoxir對鼻咽癌細胞放療抗性的影響。研究發現，etomoxir與放療聯用組對放療抵抗細胞克隆形成能力的抑制作用明顯高于順鉑與放療聯用組。用鼻咽癌放療抵抗細胞構建裸鼠移植瘤模型證實與單獨放療相比，etomoxir與放療聯用能顯著抑制瘤體生長，增加腫瘤細胞凋亡。本發明通過體外和體內實驗證明，etomoxir抑制鼻咽癌放療抵抗細胞的脂肪酸β氧化，增加放療抵抗細胞對放療的敏感性，可作為靶向藥物應用于鼻咽癌放射治療。

附圖說明

圖1：

A顯示鼻咽癌放療抵抗細胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A mRNA水平高于放療敏感細胞CNE2、HK1；

B顯示鼻咽癌放療抵抗細胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A蛋白表達水平高于放療敏感細胞CNE2、HK1；

C顯示鼻咽癌放療抵抗細胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A酶活性水平高于放療敏感細胞CNE2、HK1。

圖2：

A顯示CPT1A mRNA水平增高降低頭頸部鱗癌患者的總生存期；

B顯示CPT1A蛋白表達水平增高降低放療后鼻咽癌患者的總生存期；

圖3：

A顯示CNE2-IR細胞脂肪酸β氧化能力增強；

B顯示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的ATP含量；

C顯示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的NADPH含量；

圖4：

A顯示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的線粒體膜電位；

B顯示etomoxir增加CNE2-IR、HK1-IR細胞的凋亡水平；

圖5：顯示etomoxir單獨或與放療聯用明顯降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的存活分數；

圖6：

A顯示etomoxir單獨或etomoxir與放療聯合處理明顯降低CNE2-IR裸鼠移植瘤的生長速率；

B顯示etomoxir單獨或etomoxir與放療聯合處理明顯降低CNE2-IR裸鼠移植瘤的體積和重量。

具體實施方式

本發明所用鼻咽癌細胞系CNE2細胞為中國醫學科學院腫瘤研究所建系，CNE2-IR是以CNE2為母細胞經過總劑量為80Gy照射建立的放療抵抗細胞，為湘雅醫院耳鼻喉科建系。HK1細胞為香港伊麗莎白醫院放射與腫瘤科所建，HK1-IR是以HK1為母細胞經過總劑量為60Gy照射建立的放療抵抗細胞，為中南大學腫瘤研究所建系。

實施例1.鼻咽癌放療抵抗細胞中CPT1A mRNA、蛋白表達和酶活性水平增加

A CPT1A的mRNA反映基因的轉錄水平。

實驗方法：鼻咽癌細胞在6孔板中培養，至80～90％融合時，抽提細胞RNA，再進行逆轉錄和定量PCR，檢測CPT1A的mRNA水平。

實驗結果：如圖1A所示，CNE2-IR、HK1-IR細胞中CPT1A的mRNA水平高于CNE2、HK1細胞。

B CPT1A的蛋白表達反映基因的翻譯水平。

實驗方法：鼻咽癌細胞在6孔板中培養，至80～90％融合時，抽提細胞蛋白，用Western Blot檢測CPT1A的蛋白表達水平。

實驗結果：如圖1B所示，CNE2-IR、HK1-IR細胞中CPT1A蛋白表達水平高于CNE2、HK1細胞。

C CPT1A是脂肪酸β氧化的關鍵酶，酶活性是CPT1A發揮生物學功能的關鍵。

實驗方法：鼻咽癌細胞在6孔板中培養。實驗分組為vehicle組和ETO。待細胞長至80～90％融合后，加ETO(40μM)2h后，抽提細胞總蛋白。取100μl蛋白裂解液，加入50μl DTNB顯色劑，用酶標儀檢測405nm波長的吸光度值，記為blank。再向上述體系中加入終濃度為5mM的L-肉堿和100μM的棕櫚酰輔酶A，作為CPT1酶促反應的底物，37℃孵育20min后，檢測吸光度值，用所得值減去blank即為檢測結果，再用蛋白濃度進行歸一處理即得到最終結果。

實驗結果：如圖1C所示，CNE2-IR、HK1-IR細胞中CPT1A酶活性顯著高于CNE2、HK1細胞。

實施例2.CPT1A高表達與頭頸部鱗癌或鼻咽癌患者預后不良呈正相關

A現已有多種腫瘤樣本庫公開數據供研究者分析。申請人調取TCGA數據庫中CPT1A mRNA水平及頭頸部鱗癌患者的總生存期與數據，進行分析統計。

實驗方法：查詢TCGA數據庫，數據庫包含287例頭頸部鱗癌樣本，其中有預后信息的為283例。采用mantel-cox函數分析283例樣本中CPT1A mRNA水平與總生存期生存期數據，繪制Kaplan-Meier生存期曲線，并進行統計學分析。

實驗結果：如圖2A所示，CPT1A高表達降低頭頸部鱗癌患者的總生存期，風險值為1.63(95％CI＝1.091-2.383)，結果具有統計學差異(P＝0.0165)。

B在48例鼻咽癌組織樣本中，用免疫組化方法檢測CPT1A的表達情況，用存活曲線表示CPT1A表達量與鼻咽癌患者預后的相關性。48例鼻咽癌病例均經過Co60放射治療，病理分型均為未分化磷狀上皮癌。

實驗方法如下：將組織芯片在60℃恒溫箱中烘烤30分鐘，然后置于二甲苯中浸泡5分鐘，更換新鮮二甲苯后浸泡5分鐘，再依次放入無水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中各浸泡5分鐘，蒸餾水洗滌3分鐘。然后將芯片置于0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)中，放入微波爐內高火加熱置沸騰5min，然后改用中高火繼續加熱15分鐘。PBS洗5分鐘×2次，在3％H₂O₂中室溫靜置10分鐘，PBS洗5分鐘×2次。5％驢血清封閉30分鐘后，滴加一抗，稀釋比例為1:500，4℃濕盒過夜。37℃復溫45分鐘，PBS洗5分鐘×3次，滴加二抗40～50μL，室溫靜置1小時，PBS洗5分鐘×3次，將DAB原液按1:200稀釋，顯色20-40秒(在顯微鏡下掌握染色程度)，自來水沖洗10分鐘，蘇木素復染10～20分鐘(在顯微鏡下掌握染色程度)，自來水沖洗10～15分鐘，干燥，中性樹脂封片后閱片。免疫組化評分參考許良中的判斷標準:根據著色的強弱程度評分:無著色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分；同時按陽性細胞所占的百分比計分:陽性細胞率≤10％為1分,陽性細胞率>10％且≤50％為2分,陽性細胞率>50％且≤75％為3分,陽性細胞率>75％為4分。利用SPSS 16.0軟件分析免疫組織化學結果，相關性分析采用Spearman法，用Log-rank計算p值得出統計學差異。采用mantel-cox函數分析樣本中CPT1A蛋白水平與總生存期生存期數據，繪制Kaplan-Meier生存期曲線，并進行統計學分析。

實驗結果：如圖2B所示，取48例鼻咽癌腫瘤組織CPT1A表達量的中位數，將樣本分為CPT1A低表達和高表達兩組。CPT1A高表達降低鼻咽癌患者的總生存期，風險值為0.396(95％CI＝0.157-0.996)，結果具有統計學差異(P＝0.019)。

實施例3.放療抵抗細胞系脂肪酸β氧化能力增強

A由于CPT1A的代謝底物為棕櫚酸，細胞氧化棕櫚酸需要消耗氧氣。采用seahorse代謝分析儀，在向細胞內添加棕櫚酸后，檢測CNE2和CNE2-IR細胞的耗氧率，即可反應細胞的脂肪酸β氧化效率。

實驗方法：將細胞接種于seahorse儀器專用24孔培養板，37℃培養，保證第二天單層鋪滿。同時將電極板浸沒于水化液，置于37℃無二氧化碳培養箱內孵育過夜。第二天，將細胞培養基換成饑餓培養基(DMEM，0.5mM葡萄糖，1.0mM谷氨酰胺，0.5mM肉堿，1％FBS)，培養4小時后，將培養基換成上機液(111mM NaCl，4.7mM KCl，2.0mM MgSO₄，1.2mM Na₂HPO₄，2.5mM葡萄糖、0.5mM肉堿、5mM HEPES)，繼續培養45分鐘。上機前20分鐘將電極水化板放入儀器校準。上機前，向每種細胞中分別加入BSA或BSA-棕櫚酸后，將培養板放入儀器。選擇脂肪酸β氧化程序檢測氧消耗率。將所得數值用對應細胞的蛋白濃度進行歸一得到最終結果。

實驗結果：如圖3A所示，以BSA為對照組，比較加入棕櫚酸的BSA-棕櫚酸組的氧耗率是否增加。結果發現CNE2-IR細胞在加入棕櫚酸的條件下氧耗率增加，而CNE2無明顯變化，提示CNE2-IR細胞的脂肪酸β氧化效率高于CNE2細胞。

B脂肪酸β氧化終產物乙酰輔酶A進入三羧酸循環，并偶聯線粒體氧化磷酸化生成ATP。因此細胞內ATP水平是評價脂肪酸β氧化活性的間接指標。用etomoxir單獨或聯合4Gy放療處理細胞，研究etomoxir對鼻咽癌放療抵抗細胞ATP含量的影響。

實驗方法：提前一天將細胞種于96孔板中，細胞數不少于8×10³個/孔。實驗分組為：未處理組(vehicle)、4Gy放療單獨處理組、ETO單獨處理組和ETO與4Gy放療聯用組。第二天加etomoxir(40μM)2h后，給予4Gy放療。24小時后，檢測前將試劑盒(Perkin Elmer,6016947)溫育至37℃。棄培養基，向細胞中加入100μl新鮮培養基，再加入50μl裂解液，放在震蕩器上700rpm裂解5分鐘。然后每孔加入50μl反應底物，700rpm震蕩裂解5分鐘。最后將孔板避光放置10分鐘，將96孔板中的反應體系加底部透光的白板中，在酶標儀上選擇化學發光法程序進行檢測。所得熒光值用對應孔的蛋白濃度進行歸一，得到最終結果。

實驗結果：如圖3B所示，ETO單獨或聯合4Gy放療處理均能降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的ATP含量，但ETO對CNE2、HK1細胞的ATP水平無明顯影響。

C脂肪酸β氧化終產物乙酰輔酶A進入三羧酸循環后，經異檸檬酸脫氫酶或蘋果酸脫氫酶代謝生成NADPH。細胞內NADPH含量是評價脂肪酸β氧化活性的間接指標。用etomoxir單獨或聯合4Gy放療處理細胞，研究etomoxir對鼻咽癌放療抵抗細胞NADPH含量的影響。

實驗方法：提前一天將細胞種于12孔板中，細胞數不少于1.5×10⁴個/孔。實驗分組為：未處理組(vehicle)、4Gy放療單獨處理組、ETO單獨處理組和ETO與4Gy放療聯用組。第二天加etomoxir(40μM)2h后，給予4Gy放療。24小時后，用NADPH定量檢測試劑盒檢測(Biovision,#K37-100)。胰酶消化細胞，收集細胞沉淀，加入50μl蛋白裂解液，冰上放置10分鐘，10000g離心10分鐘。取上清，60℃孵育30分鐘。然后向每孔中加入98μl反應緩沖液和2μl反應酶。室溫孵育5分鐘后，加入5μl顯色劑，繼續室溫孵育20分鐘。在酶標儀上用450nm波長檢測吸光度值。所得熒光值用對應孔的蛋白濃度進行歸一，得到最終結果。

實驗結果：如圖3C所示，ETO單獨或聯合4Gy放療處理均能降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的NADPH含量，但ETO對CNE2、HK1細胞的NADPH水平無明顯影響。

實施例4.Etomoxir降低鼻咽癌放療抵抗細胞的線粒體膜電位，增加放療抵抗細胞的凋亡水平

A線粒體膜通透性的改變是凋亡的重要早期事件，表現為線粒體跨膜電位降低。JC-1熒光染料在正常細胞中以多聚體形式聚集于線粒體并顯紅色熒光。在凋亡細胞中，由于線粒體膜電位降低，JC-1染料在線粒體的聚集減少，以單體形式存在于細胞漿并顯綠色熒光。因此，JC-1染料紅色熒光與綠色熒光強度的比值反映線粒體膜電位高低。

實驗方法：提前一天將細胞種于12孔板中，細胞數不少于1.5×10⁴個/孔。實驗分組為：未處理組(vehicle)、4Gy放療單獨處理組、ETO單獨處理組和ETO與4Gy放療聯用組。第二天加etomoxir(40μM)2h后，給予4Gy放療。24小時后，胰酶消化細胞，收集細胞沉淀。向細胞中加入用1XPBS配置的JC-1染料，終濃度為1-5μM。37℃避光孵育30分鐘后，用流式細胞儀檢測熒光強度。

實驗結果：如圖4A所示，ETO單獨或聯合4Gy放療處理均能降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的線粒體膜電位，但ETO對CNE2、HK1細胞的線粒體膜電位無明顯影響。

B細胞凋亡的標志性改變是磷酯酰絲氨酸從細胞膜內轉移到細胞膜外。Annexin V是一種磷脂結合蛋白，與磷酯酰絲氨酸高度親和，與暴露在細胞膜外的磷酯酰絲氨酸結合，指示凋亡的發生。zVAD是泛caspase抑制劑，用于抑制凋亡。

實驗方法：提前一天將細胞種于12孔板中，細胞數不少于1.5×10⁴個/孔。實驗分組為：未處理組(vehicle)、4Gy放療單獨處理組、ETO單獨處理組、ETO與4Gy放療聯用組、ETO與4Gy放療聯用組加zVAD組。第二天加etomoxir(40μM)2h后，給予4Gy放療。24小時后，胰酶消化細胞，收集細胞沉淀。向細胞中加入用Annexin V-FITC染料(凱基生物，KGF001)，稀釋比例為1:100。室溫避光孵育20分鐘后，用流式細胞儀檢測綠色熒光強度。

實驗結果：如圖4B所示，ETO單獨或聯合4Gy放療處理均能增加CNE2-IR、HK1-IR細胞的凋亡水平，并能被凋亡抑制劑zVAD逆轉。ETO對CNE2、HK1細胞的凋亡無明顯影響。

實施例5.Etomoxir增加放療抵抗細胞對放療的敏感性

平板集落形成實驗是評價細胞放療抵抗能力的金標準，其結果用存活分數或存活曲線表示。以臨床上常用的與放療聯用的化療藥物順鉑(Cisplatin)為陽性對照，在4Gy放療條件下，評價etomoxir對鼻咽癌細胞放療抵抗能力的影響。

實驗方法：將細胞種于6孔板，2000個/孔，細胞呈單克隆分布。實驗分組為：未處理組(vehicle)、4Gy放療單獨處理組、ETO單獨處理組和ETO與4Gy放療聯用組。第二天加etomoxir(80μM)2h后，給予4Gy放療。待單個細胞生長至細胞數大于等于50的集落，約10-14天，用1XPBS洗細胞兩遍，再用甲醇固定10分鐘。然后，用結晶紫染色15分鐘。流水沖洗，晾干后，掃描培養板，用Image J計數染色集落。根據以下公式，計算細胞存活分數：

克隆形成率＝克隆數/接種的細胞數

存活分數＝受照射細胞的克隆形成率/對照細胞的克隆形成率

實驗結果：如圖5所示，放療抵抗細胞在4Gy放療后存活分數明顯高于放療敏感細胞，說明CNE2-IR和HK1-IR細胞具有放療抵抗能力。順鉑能降低四種鼻咽癌細胞的存活分數，但CNE2-IR和HK1-IR細胞對順鉑的敏感程度低于CNE2和HK1。而與順鉑相比，ETO能更明顯地降低CNE2-IR和HK1-IR細胞的存活分數。以順鉑作為放療增敏的陽性對照藥物，以上結果說明，ETO聯用放療比順鉑聯用放療能更有效地抑制放療抵抗細胞的存活。

實施例6.Etomoxir增加CNE2-IR細胞裸鼠移植瘤對放療的敏感性，表現為瘤體生長速率減慢和瘤體體積減小

本實驗用鼻咽癌放療抵抗細胞系CNE2-IR構建裸鼠移植瘤模型，用體內實驗驗證etomoxir的放療增敏作用。

實驗方法：4周齡免疫缺陷小鼠Bclb共16只購自中南大學動物學部，經本室飼養一周后，將5x10⁶個CNE2-IR細胞，以100μl生理鹽水懸浮后，接種于裸鼠右側背部。待裸鼠成瘤并且瘤體體積約為130mm³時，將裸鼠分成4組，每組4只，分別為對照組、放療組、etomoxir治療組和放療與etomoxir聯用組。第一次放療或給藥的時間記為第一天。

對照組：從第一天開始，隔天腹腔注射100μl生理鹽水，維持3周；

放療組：從第一天開始，隔天腹腔注射100μl生理鹽水，維持3周。并且在第1、3,、7、9天分別給予2Gy放療；

Etomoxir治療組：從第一天開始，隔天腹腔注射100μl etomoxir，按50mg/kg劑量給藥，維持3周；

放療與etomoxir聯用組：在同上etomoxir治療組基礎上，在腹腔注射etomoxir后2h給予放療，放療方案同放療組。

從分組后第一天開始測量裸鼠體重及瘤體體積，隔天測量一次，3周后二氧化碳窒息處死小鼠，剝離瘤體，并稱量瘤體重量。

實驗結果：

如圖6A所示，單獨放療、Etomoxir治療均能抑制裸鼠移植瘤生長。Etomoxir與放療聯用對裸鼠移植瘤的生長抑制作用最明顯。

如圖6B所示，單獨放療、Etomoxir治療均能減少裸鼠移植瘤的體積和重量。Etomoxir與放療聯用對裸鼠移植瘤的體積和重量的抑制作用最明顯；

以上結果說明etomoxir能增加放療抵抗的移植瘤模型對放射治療的敏感性。