本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記Pi2-1及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻作為世界上主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量的高低直接影響全球糧食安全。水稻稻瘟病作為真菌性病害已成為熱帶和溫帶國家水稻最主要的病害，其大規(guī)模爆發(fā)可使水稻嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收。尤其表現(xiàn)在中國的雜交水稻育種中，由于雜交水稻發(fā)展過程中親本間的遺傳關(guān)系較近，遠(yuǎn)緣優(yōu)異抗病資源引入較少，導(dǎo)致雜交水稻抗病性改良進(jìn)展緩慢。目前對于水稻稻瘟病主要以預(yù)防為主，在水稻生長抽穗初期噴施化學(xué)農(nóng)藥加以防治。然而這樣又帶來了水稻生產(chǎn)成本的的提高、水稻食用安全以及環(huán)境污染等問題。

培育抗稻瘟病水稻新品種是解決以上諸多問題既經(jīng)濟(jì)環(huán)保又安全高效的有效途徑。傳統(tǒng)的育種方法將抗病品種與感病品種雜交，在后代根據(jù)抗病表型選擇優(yōu)異后代的方法，具有表型鑒定年際間不穩(wěn)定、選擇過程容易丟失抗病性的弊端。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尤其水稻基因組學(xué)，為稻瘟病基因的鑒定克隆奠定了良好的基礎(chǔ)。截至目前，已經(jīng)克隆的水稻抗稻瘟病基因已有21個，另有多個已被精細(xì)定位。伴隨著水稻抗稻瘟病基因的精細(xì)定位與克隆，與水稻抗稻瘟病基因緊密連鎖甚至共分離的分子標(biāo)記則可用于水稻抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助選擇。

水稻抗稻瘟病基因Pi2于2006年被克隆，該基因具有廣譜抗性，被廣泛應(yīng)用于水稻抗稻瘟病遺傳改良。現(xiàn)有技術(shù)中水稻抗稻瘟病基因Pi2的應(yīng)用主要體現(xiàn)在開發(fā)與Pi2緊密連鎖的分子標(biāo)記用于Pi2分子標(biāo)記輔助選擇。然而，這些開發(fā)的標(biāo)記多為SSR標(biāo)記與Pi2為連鎖關(guān)系，位于Pi2基因外部，隨著遺傳選擇世代的增加，標(biāo)記與Pi2的連鎖關(guān)系往往會被打破，導(dǎo)致標(biāo)記跟蹤失效，利用效率低下。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記及應(yīng)用，本發(fā)明根據(jù)基因內(nèi)部核苷酸序列在不同品種之間的差異(包括變異和缺失)，通過設(shè)計基因內(nèi)部的In-Del(插入-缺失)標(biāo)記，將不同水稻品種類型的基因型分開，該方法具有穩(wěn)定性(不同的堿基缺失在不同水稻品種中穩(wěn)定存在)和標(biāo)記追蹤可靠性(標(biāo)記在基因內(nèi)部與基因共分離)。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記Pi2-1，功能分子標(biāo)記所擴(kuò)增的DNA片段包含水稻抗稻瘟病基因Pi2基因組序列的第1543-1545位核苷酸，某些水稻感稻瘟病品種在該位點(diǎn)存在ACA 3個堿基缺失，由引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2從水稻基因組中擴(kuò)增出抗稻瘟病基因Pi2的DNA片段，經(jīng)電泳檢測DNA片段大小，從而確定水稻抗稻瘟病基因Pi2的完整性，進(jìn)而確定其稻瘟病抗性。

本發(fā)明還公開了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記Pi2-1的引物對，所述引物對的正向引物如SEQ ID NO.1所示，所述引物對的反向引物如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明還公開了一種鑒定水稻抗稻瘟病基因Pi2的方法，包括以下步驟：

1)通過常規(guī)PCR法擴(kuò)增及測序，獲得水稻抗稻瘟病基因Pi2的1個抗病等位基因與1個感病等位基因序列；

2)將步驟1)所獲得的序列進(jìn)行比對，得到水稻抗稻瘟病基因Pi2的第1543-1545位點(diǎn)處存在ACA 3個堿基缺失，該差異位于該基因的外顯子；

3)對不同水稻的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測驗證，獲得與水稻抗稻瘟病基因Pi2呈特異性帶型的核苷酸片段；

4)對步驟3)所獲得的分子標(biāo)記在不同的水稻品種中進(jìn)行帶型顯色和基因型分型，從而確定水稻抗稻瘟病基因Pi2的完整性，進(jìn)而確定其稻瘟病抗性。

進(jìn)一步地，步驟3)中的PCR反應(yīng)體系如下：

進(jìn)一步地，電泳檢測中的8％聚丙烯酰胺凝膠的組成如下：

進(jìn)一步地，顯色中的聚丙烯酰胺凝膠顯色液100ml的組成如下：

本發(fā)明還公開了一種上述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記Pi2-1在篩選和鑒定水稻稻瘟病抗性品種中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：本發(fā)明利用水稻抗稻瘟病基因Pi2開發(fā)了新的Pi2功能分子標(biāo)記。這些功能分子標(biāo)記的開發(fā)將有助于將Pi2導(dǎo)入不同的水稻遺傳背景中進(jìn)而利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)快速高效地篩選到新的抗稻瘟病水稻新品種。

當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明Pi2-1抗病品種和感病品種基因型分析；其中，1-12，分別為抗病品種：粵農(nóng)絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號；13-24，分別為感病品種：桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團(tuán)黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854；

圖2是本發(fā)明各抗稻瘟病品種和感稻瘟病品種抗性表型鑒定；其中，1-12，分別為抗病品種：粵農(nóng)絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號；13-24，分別為感病品種：桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團(tuán)黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854；

圖3是本發(fā)明Pi2-1在R900/華占F₂群體中的基因型分型分析；其中，1華占；2，R900；3-24，R900/華占F₂分離群體中各單株的基因型分型；

圖4是本發(fā)明華占，R900以及R900/華占F₂群體中與圖3中各單株基因型相對應(yīng)的稻瘟病抗病表型，其中，1華占；2，R900；3-24，R900/華占F₂分離群體中各單株的基因型分型。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

實施例1水稻抗稻瘟病基因Pi2在不同水稻品種中的基因序列分析和功能分子標(biāo)記開發(fā)

水稻材料：粵農(nóng)絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號，桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，昌香恢1號，麗江新團(tuán)黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854。

對上述不同水稻品種中的抗稻瘟病基因Pi2進(jìn)行測序，進(jìn)一步對所測的各品種抗稻瘟病基因Pi2的基因組序列進(jìn)行比對分析(表1)。根據(jù)比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)某些測序品種中Pi2基因組序列的外顯子區(qū)域存在1處有規(guī)律的連續(xù)3個堿基缺失。進(jìn)一步根據(jù)稻瘟病抗性表型鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Pi2基因組序列1543-1545位點(diǎn)處存在3個堿基(ACA)缺失的，該品種稻瘟病抗性表現(xiàn)為感病。而在該位點(diǎn)處不存在堿基缺失的，這類品種稻瘟病抗性表現(xiàn)為抗病(表1)。另外根據(jù)測序分析發(fā)現(xiàn)，與Pi2相鄰的基因LOC-Os06g17920，其基因組序列與Pi2非常相似，尤其在Pi2基因組序列1543-1545位點(diǎn)處附近，這兩個基因的基因組序列幾乎完全一樣。

表1不同水稻品種抗稻瘟病基因Pi2全基因組測序及SNP分型分析

因而根據(jù)抗稻瘟病基因Pi2在不同品種中測序比對分析，進(jìn)一步結(jié)合抗性表型鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在Pi2基因組序列1543-1545處，感稻瘟病品種存在3個堿基(ACA)的缺失，抗病品種則不存在堿基缺失。基于上述結(jié)果，我們在此處開發(fā)1個In-Del標(biāo)記，Pi2-1；Pi2-1標(biāo)記在抗病品種中擴(kuò)增出1個片段長度為65bps(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的單一條帶；在感病品種中擴(kuò)增出2個片段條帶，一條為擴(kuò)增LOC-Os06g17920基因組所具條帶，片段長度65bps；另一條為擴(kuò)增Pi2基因組所具條帶，由于存在3個堿基缺失，因而片段長度為62bps(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。Pi2-1即為水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記。在水稻抗稻瘟病分子標(biāo)記鑒定時，利用這個功能分子標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行標(biāo)記基因型鑒定，凡是擴(kuò)增出65bps單一條帶的，表明該品種不存在堿基缺失，Pi2基因功能正常，具有稻瘟病抗性。而擴(kuò)增出2個片段條帶的(65bps和62bps)，則表明該品種Pi2基因存在3個堿基缺失，基因功能不正常，稻瘟病抗性較差。因此利用Pi2-1可將抗稻瘟病品種和稻瘟病抗性較差品種，快速高效區(qū)分。

實施例2新的水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標(biāo)記在抗病水稻品種和感病水稻品種中的基因型分型檢測

(1)水稻材料：粵農(nóng)絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，R227，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號，長松粳；桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團(tuán)黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854。

(2)水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標(biāo)記在不同水稻品種中基因型鑒定

利用上述針對水稻抗稻瘟病基因Pi2開發(fā)的功能分子標(biāo)記對不同水稻品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系如下)，之后通過體積分?jǐn)?shù)為8％的聚丙烯酰胺凝膠(凝膠配置方法如下)電泳分離，對標(biāo)記在不同水稻品種中進(jìn)行帶型顯色和基因型分型(顯色液配置方法如下)；之后結(jié)合各水稻品種抗稻瘟病表型鑒定結(jié)果，進(jìn)而確定功能分子標(biāo)記的實用性。

PCR反應(yīng)體系：

8％聚丙烯酰胺凝膠配方:

聚丙烯酰胺凝膠顯色液配方(100ml)：

注：甲醛是臨用前現(xiàn)加，其他三個按相應(yīng)量提前配好。

經(jīng)上述檢測后結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，水稻品種：粵農(nóng)絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，R227，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號，長松粳表現(xiàn)基因型一致，標(biāo)記Pi2-1，擴(kuò)增片段長度均為單一條帶65bps(圖1，1-12)。抗稻瘟病表型鑒定結(jié)果顯示這些品種抗性為中抗水平，具有稻瘟病抗性(圖2，1-12)。然而水稻品種：桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團(tuán)黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854基因型鑒定表明這些品種在標(biāo)記Pi2-1的擴(kuò)增片段長度均為兩條帶，一條65bps，另一條62bps(圖1，13-24)。抗稻瘟病表型鑒定結(jié)果表明這些品種稻瘟病抗性較差，均有不同程度的感病現(xiàn)象(圖2，13-24)。因而水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記Pi2-1，在不同水稻品種中基因型分型清晰明確，且不同基因型與抗稻瘟病表型能較好對應(yīng)吻合，表明Pi2-1這個功能分子標(biāo)記具有實用性。

實施例3、新的水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標(biāo)記在R900/華占F₂群體中篩選新的水稻抗稻瘟病單株。

利用上述水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標(biāo)記Pi2-1，在水稻抗稻瘟病品種華占和感稻瘟病品種R900構(gòu)建的F2群體中，逐株檢測其基因型。同時在水稻孕穗期(幼穗分化3-5期)，采用混合水稻稻瘟病孢子接種，鑒定各單株稻瘟病穗莖瘟抗性表型。

分析結(jié)果表明，在檢測到的基因型表現(xiàn)為，標(biāo)記Pi2-1擴(kuò)增片段長度表現(xiàn)為單一條帶65bps，表現(xiàn)為抗病基因型的112個單株中，有104個具有抗稻瘟病表型。基因型與表型的吻合率達(dá)92.8％(圖3，圖4)；在檢測到的基因型表現(xiàn)為標(biāo)記Pi2-1，擴(kuò)增片段長度為兩條帶，一條，65bps，另一條，62bps，表現(xiàn)為感病基因型或雜合基因型的259個單株中，有91個具有感稻瘟病表型(圖3，圖4)。因而利用Pi2-1這個水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標(biāo)記，能從各分離群體中快速高效的篩選出基因型純合的具有稻瘟病抗性的單株和株系。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水稻研究所

<120> 一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標(biāo)記Pi2-1及應(yīng)用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttggattgga gcattattcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcatgtgcta gactcttggg t 21

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 抗稻瘟病基因

<400> 4

ttggattgga gcattattcg atcattagct atttttggtg acagacccaa gagtctagca 60

catgc 65

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 抗稻瘟病基因

<400> 4

ttggattgga gcattattcg atcattagct atttttggtg gacccaagag tctagcacat 65

gc 62