本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種哈蟆油真偽鑒別的方法及專用引物。

背景技術：

哈蟆油(Ranae oviductus)為蛙科動物中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的輸卵管，經采制干燥而得。具有補腎益精，養陰潤肺的功效，用于病后體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗，癆嗽咳血。是一種集食用藥用于一身的名貴中藥材。由于多方面原因導致哈蟆油嚴重的供不應求，致使偽品充斥于市。目前市場上的偽品哈蟆油主要有黑龍江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油4類，其它偽品類型少見。2015年版《中國藥典》規定哈蟆油的鑒別方法為性狀鑒定、高效液相色譜法鑒定及膨脹度測定法，但這些方法易受人為因素、環境條件或藥材本身的限制，實踐中哈蟆油的鑒定仍感到十分困難。

隨著分子生藥學的發展，分子鑒定技術在哈蟆油藥材的鑒別中得到不斷的應用，很大程度上彌補了傳統鑒別方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鑒別方法，從模板的提取、PCR反應到最終結果分析，單個樣品的鑒定步驟繁瑣，耗時長，且需要電泳檢測或序列分析比對，不利于現場快速鑒別的使用。

隨著分子生物學的發展，分子鑒定技術已成為中藥材傳統鑒別方法的有益補充。有關哈蟆油的PCR鑒別方法已有報道，但是由于哈蟆油藥材本身遇水膨脹，給哈蟆油的DNA提取帶來極大的困難，提取過程復雜，成功率低，制約了該方法的深入應用。

快速PCR在保證PCR反應特異性和準確性的前提下，通過縮短反應時間來達到快速檢測目的，尤其是和熒光檢測技術相結合，進一步提高了檢測效率，有望實現中藥材的現場、快速檢測。快速PCR技術和產物熒光檢測的實現，對引物設計有嚴格的要求。為達到快速擴增的目的，設計引物時上下游引物距SNP位點盡可能近，PCR產物應盡可能短；引物Tm值與延伸溫度接近，以減少PCR反應的升降溫溫差。為達到使用熒光檢測的目的，引物設計應避免引物二聚體對檢測結果的影響，這就要求引物質量要好，擴增過程中無引物二聚體的產生；使用的酶質量要好，能有效抑制引物二聚體的形成；有些情況下引物二聚體是不可避免的，可以通過調整酶、引物用量、加入PCR增強劑等方法，減少其對熒光檢測結果的影響。

近年來，快速PCR方法已成功用于金銀花，蛇類，太子參，人參、西洋參等中藥材的真偽鑒別。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供用于哈蟆油真偽鑒別的引物對。

本發明提供的引物對，為能擴增出DNA片段A的引物對；

所述DNA片段A是以哈蟆油為模板，用序列1和序列2所示引物對進行擴增得到的產物。

上述引物對中，所述DNA片段A的核苷酸序列為序列5；

或，所述引物對由引物1和引物2組成；

所述引物1為如下1)或2)：

1)為序列1所示的單鏈DNA分子；

2)為序列1刪除和/或增加和/或改變一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA分子；

所述引物2為如下3)或4)：

3)為序列2所示的單鏈DNA分子；

4)為序列2刪除和/或增加和/或改變一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA分子。

本發明第二個目的是提供一種用于鑒定或輔助哈蟆油的PCR試劑。

上述PCR試劑中，包括上述的引物對、DNA聚合酶和dNTP。

上述PCR試劑中，

所述引物對中每條引物在所述PCR試劑中的濃度均為2nmol/l；

和/或，各個dNTP在所述PCR試劑中的濃度具體為2.5nmol/l；

和/或，所述DNA聚合酶具體為SpeedStar HS Taq DNA聚合酶或Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶。

本發明第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定哈蟆油的試劑盒。

本發明提供的試劑盒，，包括上述的引物或上述的PCR試劑。

上述DNA片段A也是本發明保護的范圍。

上述的引物或上述的PCR試劑或上述的試劑盒或上述的DNA片段A在如下(A1)-(A5)中任一種中的應用也是本發明保護的范圍：

(A1)鑒定或輔助鑒定哈蟆油；

(A2)鑒別或輔助鑒別哈蟆油；

(A3)鑒別或輔助鑒別哈蟆油及其偽品；

(A4)鑒定或輔助鑒定待測樣品是否為哈蟆油；

(A5)鑒定或輔助鑒定待測樣品是哈蟆油還是其偽品。

本發明第四個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測樣品是否為哈蟆油的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：檢測待測樣品中是否含有權利要求6所述的DNA片段A；如果含有，則待測樣品為或候選為哈蟆油；如果不含有，則待測樣品不為或候選不為哈蟆油。

上述方法中，

所述檢測待測樣品中是否含有DNA片段A的方法包括如下步驟：

1)用上述的引物對待測樣品進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

2)用如下a或b檢測所述PCR擴增產物：

a、向所述PCR擴增產物中加入DNA熒光染料，紫外檢測，若PCR擴增產物有熒光，則待測樣品含有所述DNA片段A，若PCR擴增產物無熒光，則待測樣品不含有所述DNA片段A；

b、檢測所述PCR擴增產物大小，若大小為520-530bp，則所述待測樣品含有所述DNA片段A，若大小不為520-530bp，則所述待測樣品不含有所述DNA片段A。

上述方法中，所述PCR擴增的模板為待測樣品的基因組DNA；

所述PCR擴增條件為90℃3s，62℃20s，32個循環。

所述DNA片段A的核苷酸序列為序列表中序列5。

所述引物1和所述引物2的摩爾比為1:1。

所述PCR試劑由上述的引物對、DNA聚合酶、dNTP、PCR緩沖液和水組成。

所述偽品具體為黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油和/或牛蛙油。

本項研究基于快速PCR方法對哈蟆油及其常見混偽品(黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油)進行鑒別研究，有效的提高哈蟆油鑒別反應效率，為哈蟆油藥材的鑒別提供更加符合實際需要、簡便快捷的方法。

上述待測樣品通過堿裂解法獲得DNA，整個提取過程僅需5min即可完成，為后續快速PCR方法的建立奠定了基礎。

本研究通過對位點特異性PCR進行條件優化，實現了在40min內簡單、快速、直觀的鑒別哈蟆油及其常見混偽品的目的，有助于實現哈蟆油藥材現場、準確、快速鑒定。本研究對哈蟆油常見的4種蛙類混偽品進行了鑒別研究，對于哈蟆油非蛙類的偽品如：鱈魚精巢及瓊脂蛋白胨、馬鈴薯加工品沒有涉及，因此本研究所建立方法對于非蛙類偽品的適用性有待于進一步研究。

附圖說明

圖1為mcb398/mcb869通用引物擴增。

圖2為引物篩選電泳圖。

圖3為樣品驗證圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中藥材為收集不同產地中國林蛙10批、黑龍江林蛙4批、黑斑蛙4批、中華大蟾蜍4批，牛蛙2批、哈蟆油3批、牛蛙油1批。所有基原動物按傳統加工方法分別制成哈蟆油、黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另選取哈蟆油藥材3批進行快速PCR方法研究。樣品分別采自吉林、黑龍江、遼寧、內蒙古、山東、江蘇、湖南、四川等地。經黑龍江中醫藥大學中藥資源與開發教研室王振月教授鑒定，憑證標本保存于哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，見表1。

表1 實驗材料

下述實施例中部分儀器如下：S1000型梯度PCR儀(Bio-rad公司)；ETC811型PCR儀(東勝興業科學儀器有限公司)；22R型高速冷凍微量離心機(Beckman公司)；ZH-2型漩渦震蕩器(天津藥典標準儀器廠)；MM400型球磨機(Retsch公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；310型凝膠成像系統(UVP公司)，2000C型分光光度計(NanoDrop公司)。

下述實施例中部分試劑如下：瓊脂糖(西班牙Biowestagarose)；Gelred購自Biotium公司；SpeedStar HS TaqDNA聚合酶、r Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNAMarker購自TaKaRa公司；Transfast Taq DNA聚合酶購自Transgen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶購自Vazyme公司；SYBR Green Ⅰ購自Invitrogen公司；其他試劑均為國產分析純。

實施例1、哈蟆油真偽鑒別引物的設計和方法的建立

一、基于Cytb序列的哈蟆油位點特異性鑒別引物設計

從GenBank中下載得到中國林蛙、黑龍江林蛙、黑斑蛙、中華大蟾蜍、牛蛙Cyt b序列。測序所得序列使用軟件CodonCode Aligner校對拼接，去除引物區，將下載和測序獲得序列使用BioEdit軟件進行比對，篩選出哈蟆油特有的變異位點，根據變異位點使用Primer premier 5.0軟件進行引物設計，在引物3′末端倒數第二位引入人為錯配。設計出2對鑒別引物，別命名為155S-F/155S-R(擴增片段約為530bp，序列5)，698S-F/698S-R(擴增片段約為105bp)，序列見表2。引物由Invitrogen公司合成。

表2 引物及PCR反應條件

二、哈蟆油真偽鑒別方法的建立

1、基因組DNA提取及檢測

稱取10mg研磨好的表1所示的藥材粉末，使用堿裂解法提取總DNA，采用10％的Chelex-100進行純化，并用超微量分光光度計檢測DNA的濃度及純度。

將濃度稀釋為20ng·μL^-1，于-20℃保存備用。選擇通用引物mcb398和mcb869對哈蟆油及其混偽品樣品進行擴增。引物序列及擴增程序見表2。

PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統中觀察并記錄，并對PCR產物進行雙向測序。

結果如圖1所示，M:DL2000Marker；1-13：哈蟆油；14-17：黑龍江林蛙油；18-21：蟾蜍油；22-25：黑斑蛙油；26-27：牛蛙油；28：陰性對照；表明提取的DNA可以滿足PCR反應的要求。

2、引物的優化

根據引物的Tm值及產物長度設置PCR反應的初始反應條件如下：

20μL PCR反應體系：2.0μL 10×buffer，1.6μL dNTPs(2.5mmol·L-1)，0.5μL上游及下游引物(10mmol·L-1)，0.1μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1μL(約20ng)模板DNA，無菌雙蒸水補足至20μL。PCR反應在S1000型PCR儀上進行，初始反應程序見表2。

上述上游及下游引物分別為155S-F/155S-R和698S-F/698S-R。

反應結束后取PCR反應產物6μL，加入2μL 6×Loading buffer混勻后于Gelred染色的1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察、成像。

結果如圖2所示，A為698S-F/698S-R擴增電泳圖，其中，左到右的泳道分別為M：Marker；1，2：哈蟆油；3：黑龍江林蛙油；4：黑斑蛙油；5：蟾蜍油；6：牛蛙油；B為155S-F/155S-R擴增電泳圖，其中，左到右的泳道分別為M：Marker；1，2：哈蟆油；3：黑龍江林蛙油；4：黑斑蛙油；5：蟾蜍油；6：牛蛙油,可以看出，設計的2對位點特異性鑒別引物中，155S-F/155S-R的PCR擴增特異性較698S-S/698S-R引物好，故本研究選取155S-F/155S-R作為哈蟆油及其偽品的鑒別引物，具體方法如下：

用155S-F/155S-R擴增待測樣本，若得到155S-F/155S-R對應的擴增產物，則待測樣本為或候選為哈蟆油，若未得到該擴增產物，則為或候選為哈蟆油偽品。155S-F/155S-R對應的擴增產物大小為530bp，530bp擴增產物的核苷酸序列為序列5。

3、PCR反應體系及反應條件的優化

在位點特異性PCR引物設計中人為的引入了錯配位點，因此要求嚴格的反應條件，兼顧快速PCR的擴增效率，本文采用兩步法，30個循環進行PCR反應條件的優化。在此基礎上依次對退火溫度、循環數、變性溫度、變性時間、退火時間、引物用量、dNTP用量、哈蟆油模板DNA用量進行考察。

20μL PCR反應體系：2.0μL 10×buffer(TaKaRa公司，RR070A)，1.6μL dNTPs，0.5μL 155S-F，0.5μL 155S-R，0.2μL DNA聚合酶，1μL(約20ng)模板DNA，無菌雙蒸水補足至20μL。

上述Taq酶種類分別如下：rTaq DNA聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，Phanta Max Super-Fidel ity DNA聚合酶，Transfast Taq DNA聚合酶；

上述各條引物在反應體系中的終濃度分別為2、3、5pmol/L；

上述dDNP在反應體系中的終濃度分別為2.5nmol、4nmol/L。

上述模板DNA在反應體系中的終濃度分別為10—60ng；

上述PCR擴增采用不同PCR儀分別如下：S1000型PCR儀(Bio-rad公司)，ETC811型PCR儀(東勝興業科學儀器有限公司)，

上述PCR擴增的反應程序如下：95，90，88，86℃變性5，3，1s；65，64，62，61，60℃退火20，18，16，10s；35，32，30，28個循環。

結果如下，①在退火溫度60-64℃，哈蟆油擴增條帶隨溫度的升高逐漸減弱，62℃時目的條帶亮度較強，混偽品均未檢出條帶，熒光檢測結果與電泳結果一致，故本研究選擇62℃作為退火延伸溫度。②當循環數≥30時，哈蟆油樣品可以得到目的條帶，但是循環數為30時，熒光檢測結果不明顯，兼顧擴增產量與反應時間，故本文選擇32次循環。③當變性溫度≥88℃時，可以得到目的條帶，隨著變性溫度的降低，PCR成功率隨著降低，但是88℃時條帶弱，故選擇90℃作為變性溫度。④變性時間為3s時仍然可以進行有效擴增，故選擇3s作為變性時間。⑤退火延伸時間對擴增成功率有著重要影響，退火時間超過18s時才能獲得有效的擴增，此次選擇20s為退火時間。⑥當引物用量在2-5nmol時，哈蟆油樣品有目的條帶，但是隨著引物用量的提高，正品與混偽品的熒光檢測結果區別越不顯著，這可能是生成了引物二聚體，影響到熒光檢測結果，故本文選擇其用量為2nmol。⑦當dNTP用量為2.5nmol時，能夠擴增出明顯的條帶，隨著其用量的增加條帶逐漸變弱，因此將其用量定為2.5nmol，引物和dNTP用量均不宜太高，這與學者報道相符。⑧當模板用量10—60ng時均只有哈蟆油樣品擴增出單一的目的條帶，熒光檢測結果與電泳結果一致。

采用以上反應條件分別使用四種快速DNA聚合酶，其中SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶均能實現對哈蟆油的真偽鑒別，r Taq DNA聚合酶，Transfast Taq DNA聚合酶未能得到有效擴增。使用不同廠家型號的PCR儀對哈蟆油及同屬近緣種樣品進行快速PCR擴增，結果表明：S1000型PCR儀(Bio-rad公司)，ETC811型PCR儀(東勝興業科學儀器有限公司)，電泳檢測后均可獲得樣品的特異性目的條帶，反應條件優化見表3。

表3 哈蟆油PCR反應條件優化

注：“+”表示條帶亮；“±”表示條帶暗；“－”表示無條帶。

表中，1：哈蟆油；2：黑龍江林蛙油；3：黑斑蛙油；4：蟾蜍油；5：牛蛙油。HS Taq為SpeedStar HSTaq DNA聚合酶，Phanta為Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，TransTaq為Transfast Taq DNA聚合酶，rTaq為TaKa Ra r Taq DNA聚合酶。S1000為Bio-rad公司PCR儀(完成時間為29min)，ETC811為東勝興業科學儀器有限公司型PCR儀(完成時間為31min)。

綜合以上優化結果，確定哈蟆油快速PCR鑒別方法中的最佳反應體系如下:

PCR反應體系為20μL：2.0μL 10×buffer，1.0μL dNTPs(2.5mmol·L-1)，0.2μL上游及下游引物(終濃度為2nmol)，0.1μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1μL(約20ng)模板DNA，無菌雙蒸水補足至20μL。

最佳PCR反應參數為90℃3s，62℃20s，32個循環。

實施例2、哈蟆油真偽鑒別引物的應用

提取表1的各個藥材的基因組DNA作為模板，用上述實施例1中的二的3的最佳反應體系和最佳PCR反應參數進行擴增，得到PCR擴增產物。

檢測PCR擴增產物，若得到155S-F/155S-R對應的擴增產物，則待測樣本為或候選為哈蟆油，若未得到該擴增產物，則為或候選為哈蟆油偽品。

用如下兩種方法檢測PCR擴增產物：

1)向PCR擴增產物中加入2μL 100×SYBR GreenⅠ，并于365nm紫外波長下進行檢測，出現綠色熒光為陽性擴增產物；可以看出，哈蟆油樣品均顯示出明亮綠色熒光，而偽品不發出熒光。

2)電泳檢測上述PCR擴增產物。

155S-F/155S-R對應的擴增產物大小為530bp，進一步測序530bp擴增產物的核苷酸序列為序列5。

結果如圖3所示，M：Marker；1-13：哈蟆油；14-17：黑龍江林蛙油；18-21：黑斑蛙油；22-25：蟾蜍油；26-28：牛蛙油29：陰性對照；哈蟆油正品均擴增出目的條帶，混偽品均無條帶。

序列表

<110> 中國中醫科學院中藥研究所

<120> 哈蟆油真偽鑒別的方法及專用引物

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gatgtaaaca acggctgacc a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

ggggataagg ttgataggg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gttcctccat caaacaggct ca 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggggtgtaac tacggggtcg 20

<210> 5

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gggcttcgga tgttacaagc cgacagatct ttaaaggaaa agtaggggtg gaaggagact 60

ttgtctaggt tggaattaag ccctgtgggg ttggatgagc ccgtttggtg gagaaataag 120

aggtggatta tacttacagc tgcgatgatg aatgggagaa tgaagtggaa tgtaaagaat 180

cgggtaaggg tggcgttgtc tactgagaag ccccctcaga ttcattgaac taagtcaaag 240

ccgatgtaag gggcggctga gaggaggtta gtaattactg tagcgcctca gaaggacatt 300

tgacctcatg gtaagacata gcccacaaaa gctgtggcta tcactaagaa taggaggatt 360

acaccaatgt ttcacgtttc tttatagagg taggagccgt agtaaaggcc tcgtccgatg 420

tggaagtaaa tgcagatgaa gaagaatgac gcaccgttgg cgtggaggtt gcgaagaggt 480

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