本發明設計基因測序領域，特別是高通量測序領域，具體是一種基于Ion Torrent測序平臺的肺癌相關基因突變檢測方法、一組引物對及試劑。
背景技術：
肺癌是我國發病率和死亡率最高的癌癥，其中非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80％。目前化療是治療中、晚期肺癌的主要手段，也是患者術前、術后輔助治療的方法之一。臨床上部分患者化療效果欠佳、化療失敗，其主要原因是腫瘤細胞對抗癌藥物不敏感或產生耐藥。因此，了解患者對化療藥物敏感性的相關因素，對于肺癌患者進行個體化治療顯得尤為重要。
EGFR基因位于7p12，編碼酪氨酸激酶型受體。EGFR的酪氨酸激酶功能區由外顯子18～24編碼。EGFR與配體結合形成二聚體激活細胞內的激酶通路，進一步誘導下游通路的磷酸化，誘導細胞增殖。腺癌EGFR基因突變的發生率在亞洲人群達到50％，在不吸煙者、女性以及非粘液性腫瘤中發生率更高。迄今為止發現的EGFR基因突變主要位于外顯子18～21，尤其是G719S和L861Q，與腫瘤細胞對酪氨酸激酶抑制劑(TKI)的敏感度密切相關。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)能特異性地抑制具有EGFR基因突變的非小細胞肺癌的生長，改善預后。因此，《非小細胞肺癌臨床實踐指南(中國版)》推薦，在使用酪氨酸激酶抑制劑治療前，肺癌患者進行EGFR基因的突變檢測。
KRAS基因位于12p12.1，是常見的致癌基因，KRAS突變在吸煙者以及粘液性肺腺癌中最常見，多達30％的肺腺癌有KRAS突變，是NSCLC的預后不良因素以及EGFR-TKI療效不佳的預測指標。KRAS突變以點突變為主，常見12、13和61號密碼子的突變。當KRAS基因正常時，能控制調控細胞生長的通路，抑制腫瘤細胞生長；當KRAS發生突變時，會導致細胞內信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。根據2014年美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)的《非小細胞肺癌臨床實踐指南(中國版)》，KRAS突變和EGFR-TKI內源性耐藥有關，KRAS野生型患者建議接受EGFR-TKI治療，在患者使用EGFR-TKI藥物治療前，推薦進行KRAS基因的突變檢測。
BRAF基因位于7q34，是一種原癌基因，BRAF基因編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的轉導因子，參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡。非小細胞肺癌中BRAF突變率約為3％，其中大部分是肺腺癌。BRAF突變主要發生在15號外顯子上的激活區：如V600E、V600K、V600D，其中有80％～90％是發生V600E突變，BRAF突變導致肺癌患者對EGFR-TKI出現耐藥情況，因此檢測BRAF基因突變對于指導肺癌患者的靶向用藥具有重要意義。
PIK3CA基因位于3q26.3，PIK3CA編碼I類PIK-3-激酶(PI3K)的p110催化亞單位。PIK3CA基因突變導致p110a酶活性增強，減少細胞對生長因子的依賴、抑制細胞的凋亡、促進腫瘤細胞的侵襲。研究結果表明，非小細胞肺癌中PIK3CA基因突變率為1％～4％。PIK3CA突變通常發生在第10和21號外顯子，如E542K、E545K和H1047R。PI3K作為EGFR下游信號分子被激活，導致腫瘤細胞對EGFR-TKI等藥物出現耐藥。所以，檢測PIK3CA基因突變，可以預測肺癌患者對EGFR-TKI等藥物的耐藥性，對于指導患者的靶向用藥具有重要意義。
目前，常見的基因檢測突變方法有Sanger測序法和熒光定量PCR法。Sanger測序法中，操作繁瑣，靈敏度較低，假陰性率較高；熒光定量PCR法，每對引物只能檢測一種突變，檢測多突變位點操作繁瑣，需要樣本量較大。因此，采用靈敏度高、樣本需求量少、可同時檢測多位點突變的高通量測序法(NGS)更有利于可以研究和臨床使用。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種基于高通量測序平臺的肺癌相關基因突變檢測方法、一組引物對及試劑，以解決上述背景技術中提出的問題。本發明提供了一種肺癌相關基因基因突變的高通量檢測方法，所述相關基因包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA 4個基因50種突變位點。
作為本發明進一步的方案：上述肺癌相關基因突變情況包括檢測以下4個基因50種突變位點的突變情況：
本發明中檢測肺癌相關基因突變情況采用特異性引物多重PCR擴增的方法建庫并測序。本發明提供了一種基于Ion Torrent測序平臺的肺癌相關基因突變檢測方法，具體步驟如下：
(1)樣本DNA提取：石蠟包埋組織或新鮮組織樣本進行DNA提取，得到gDNA后進行濃度測定；
(2)目的片段擴增：將gDNA與多重PCR引物和PCR擴增試劑混合，經多重PCR反應，得到目的基因DNA片段；
(3)引物消除：將步驟(2)得到的DNA片段與引物消除試劑混合反應，降解去除PCR擴增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；
(4)接頭連接：將步驟(3)得到的DNA片段與P1接頭、特異性接頭、連接反應試劑混合進行連接反應，得到加接頭的DNA片段；
(5)磁珠純化：將加接頭的DNA片段進行磁珠純化，去除多余的小片段接頭，得到純化的DNA片段；
(6)文庫擴增：將步驟(5)的DNA片段加入文庫擴增反應液及文庫擴增引物進行PCR擴增，并采用磁珠進行純化，得到小片段的DNA文庫；
(7)文庫檢測：將步驟(6)得到的文庫采用熒光定量PCR的方法檢測文庫濃度；
(8)高通量測序：采用Ion Proton或Ion PGM測序平臺對步驟(7)得到的文庫進行高通量測序。
作為本發明進一步的方案：所述的突變位點1-50各自對應的多重PCR擴增引物依次為：
1-3，引物對1，引物序列如表1所述；
4-22，引物對2，引物序列如表1所述；
23-27，引物對3，引物序列如表1所述；
28-29，引物對4，引物序列如表1所述；
30-36，引物對5，引物序列如表1所述；
37-40，引物對6，引物序列如表1所述；
41-43，引物對7，引物序列如表1所述；
44-47，引物對8，引物序列如表1所述；
48-49，引物對9，引物序列如表1所述；
50，引物對10，引物序列如表1所述；
表1 多重PCR擴增引物對序列
作為本發明進一步的方案：步驟(2)中的反應體系為20μL體系，反應體系的組成成分具體為：
作為本發明進一步的方案：步驟(2)中PCR反應的循環數為22。
作為本發明進一步的方案：步驟(3)中引物消除試劑為Life Technologines公司的FuPa Reagent，加入量為20μL PCR反應體系加入2μL引物消除試劑。
作為本發明進一步的方案：步驟(4)中的P1接頭為：
5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’
5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’
作為本發明進一步的方案：步驟(4)中的特異性接頭是由如下正反兩個序列組成的Barcode x：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’
5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode x代表的具體序列如下：
Barcode 1：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’
5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 2：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 3：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 4：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’
5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 5：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 6：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 7：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 8：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’
5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 9：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 10：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 11：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’
5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 12：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 13：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’
5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 14：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’
5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 15：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’
5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 16：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’
5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
作為本發明進一步的方案：步驟(4)所述接頭連接反應的體系為30μL，接頭連接反應的體系具體為：
作為本發明進一步的方案：步驟(5)中所用磁珠為XP Reagent。
作為本發明進一步的方案：步驟(6)中文庫擴增反應液為PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity，文庫擴增引物為Library Amplification Primer Mix。
作為本發明進一步的方案：步驟(6)中文庫擴增體系為52μL，具體為向步驟(5)產物中加入50μL PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity和2μL Library Amplification Primer Mix。
作為本發明進一步的方案：步驟(6)中文庫擴增的PCR循環數為5～7。
本發明提供了一種試劑，該試劑包括上述引物對。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明的方法通過單次同時對EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA4個基因50種突變位點的突變情況進行檢測，可以降低了建庫成本，減少了PCR擴增中引入突變的可能性，使得測序結果更加精確，提高檢測通量及檢測靈敏度，同時也可以為肺癌的分子診斷及個體化用藥提供參考。
具體實施方式
下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
本發明公開了肺癌相關基因肺癌相關基因突變檢測方法，所有試劑均可由市場購得：其中，5×Ion AmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1Adapter和Ion XpressTM Barcode X(Life公司)，Switch Solution(Life公司)，DNA Ligase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity(Life公司)，Library Amplification Primer Mix(Life公司)。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例1：基于Ion Torrent測序平臺的肺癌相關基因突變檢測方法
本實施例采用以下試劑：5×Ion AmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1Adapter和Ion XpressTM Barcode X(Life公司)，Switch Solution(Life公司)，DNA Ligase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity(Life公司)，Library Amplification Primer Mix(Life公司)，Nuclease-Free Water，無水乙醇。
本方法實驗前需要新鮮配置一種試劑：75％乙醇。
本實驗需要用到的儀器和設備：離心機、磁力架、移液器、PCR儀、振蕩器、熒光計Qubit3.0。
主要實驗步驟：
(1)待測樣本的gDNA提取
本實施例中，gDNA樣本來自石蠟包埋組織樣本或新鮮組織樣本。采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或QIAamp DNA Mini Kit提取試劑盒，按照試劑盒說明書操作步驟提取。
(2)對待測樣本gDNA進行Qubit 3.0濃度測定
本實施例中，gDNA樣本采用dsDNA HS Assay Kit試劑盒進行濃度測定，按照試劑盒說明書操作步驟進行檢測。
(3)目的片段擴增。按照以下體系加入各試劑進行PCR擴增：
反應條件：
(4)引物清除
向PCR產物中加入2μL引物清除試劑FuPa Reagent，渦旋混勻，瞬時離心，根據如下程序進行反應：
(5)接頭連接
1)稀釋混合接頭，形成Barcode Adapter Mix；
2)在清除引物后的PCR產物中加入以下組分，渦旋混勻，瞬時離心。
P1接頭為：
5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’
5’-ATCACCGACTGCCCAIAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’
樣本接頭分別如下：
Barcode x：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’
5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode x代表的序列如下：
Barcode 1：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’
5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 2：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 3：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 4：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’
5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 5：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 6：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 7：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 8：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’
5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 9：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 10：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 11：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’
5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 12：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 13：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’
5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 14：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’
5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 15：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’
5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
Barcode 16：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’
5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
(6)純化連接產物
磁珠純化連接產物，采用XP Reagent純化產物：
1)將PCR產物轉移至1.5ml EP管內，加入45μLXP Reagent，吹打混勻；
2)室溫孵育5min；
3)將樣本放置磁力架上，靜置3mn至管內溶液澄清，小心吸取上清液并棄去；
4)加入300μL新鮮配制的75％乙醇，轉動EP管清洗磁珠，棄去乙醇；
5)重復步驟4)一次；
6)室溫晾干磁珠，不要過度干燥(風干即可，不要開裂)。
(7)文庫擴增，在純化后晾干的磁珠中加入50μL文庫擴增酶PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity和2μL文庫擴增引物Library Amplification Primer Mix，重懸磁珠，轉移至PCR管中，渦旋混勻，進行PCR擴增。
反應條件：
(8)文庫進行磁珠純化，采用XP Reagent磁珠純化產物：
1)每管加入25μL純化磁珠，渦旋混勻，低速離心，室溫孵育5分鐘。
2)將EP管置于磁力架上，吸附3min至溶液變澄清之后，將上清液轉移到另一標記的EP管中，注意不要吸到磁珠。
3)每管加入60μL純化磁珠，渦旋混勻，低速離心，室溫孵育5分鐘。
4)將EP管置于磁力架上，吸附3分鐘至溶液變澄清之后，吸去溶液，注意不要吸到磁珠。
5)吸取300μL 75％的乙醇于EP管，輕輕旋動EP管清洗磁珠。液澄清后吸去溶液，注意不要吸到磁珠。
6)重復上一步。
7)取下EP管，低速離心10秒。將EP管置于磁力架上，用移液槍吸去殘留溶液，注意管壁上不能有殘留。將EP管蓋打開，室溫靜置5分鐘，晾干磁珠。
8)吸取50μL洗脫液于EP管內，渦旋混勻，離心5秒，室溫放置5分鐘。
9)將EP管置于磁力架上，靜置3分鐘至溶液澄清后，小心轉移液體到新的EP管中，并標記文庫名稱。
(9)檢測文庫濃度
DNA文庫采用dsDNA HS Assay Kit試劑盒進行濃度測定，按照試劑盒說明書操作步驟進行檢測。文庫建議根據下列公式稀釋到200pmol/L，稀釋后使用熒光定量PCR儀定量，等質量混合后上機測序。
(10)高通量測序
對混合文庫采用Ion Proton或Ion PGM測序平臺進行高通量測序。
通過對Ion Torrent測序平臺的測序結果進行分析，所有樣本的覆蓋度均達到或超過97％，均一性平均達到100％，每次測序反應樣本的數據量分布均勻。
對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。不應將權利要求中的內容視為限制所涉及的權利要求。