本實用新型屬于試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴增試劑盒。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC,mesenchymal stem cells)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是指存在于臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，具有細(xì)胞含量高、增殖能力強，免疫原性低，并且具有取材方便，無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點。
目前獲得MSC的方法主要是組織貼壁法和酶消化法，組織貼壁法具有成本低，可更好保留細(xì)胞活性的優(yōu)點而廣泛被采用。但目前采用培養(yǎng)瓶通過組織貼壁法獲得原代MSC數(shù)量較低，因為MSC從臍帶組織中游離出來的時間不統(tǒng)一，若使用培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)，導(dǎo)致在收集已游離出來的MSC時，未游離出細(xì)胞的大量組織塊一起被拋棄而造成MSC總的數(shù)量獲得量低。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本實用新型提出一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴增試劑盒，該試劑盒克服了目前組織貼壁法獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量低的缺點。
本實用新型的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：
一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴增試劑盒，包括盒體與盒蓋，所述盒體內(nèi)設(shè)置有細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件、細(xì)胞洗滌液存儲元件、細(xì)胞消化液存儲元件、臍帶洗滌液存儲元件、臍帶采集保存液存儲元件、細(xì)胞存儲元件與細(xì)胞凍存液存儲元件，所述細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件位于所述盒體的右側(cè)，所述細(xì)胞洗滌液存儲元件、細(xì)胞消化液存儲元件、臍帶洗滌液存儲元件、臍帶采集保存液存儲元件、細(xì)胞存儲元件與細(xì)胞凍存液存儲元件均位于所述盒體的左側(cè)，所述細(xì)胞消化液存儲元件位于所述細(xì)胞洗滌液存儲元件上方，所述臍帶洗滌液存儲元件、臍帶采集保存液存儲元件、細(xì)胞存儲元件與細(xì)胞凍存液存儲元件均位于所述細(xì)胞消化液存儲元件上方，所述細(xì)胞凍存液存儲元件與所述細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件相鄰，所述細(xì)胞存儲元件位于所述臍帶采集保存液存儲元件與所述細(xì)胞凍存液存儲元件之間，所述臍帶洗滌液存儲元件位于所述臍帶采集保存液存儲元件與所述細(xì)胞消化液存儲元件之間；所述細(xì)胞存儲元件包括細(xì)胞培養(yǎng)板放置槽與6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，所述6孔細(xì)胞培養(yǎng)板設(shè)置在所述細(xì)胞培養(yǎng)板放置槽內(nèi)。
進一步，所述細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件包括細(xì)胞培養(yǎng)液放置槽與細(xì)胞培養(yǎng)液套裝，所述細(xì)胞培養(yǎng)液套裝放置在所述細(xì)胞培養(yǎng)液放置槽內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)液套裝含低糖DMEM培養(yǎng)液450ml/套、胎牛血清50ml/套、250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液10ml/套。
進一步，所述細(xì)胞洗滌液存儲元件包括細(xì)胞洗滌液放置槽與細(xì)胞洗液瓶，所述細(xì)胞洗滌液瓶放置在所述細(xì)胞洗滌液放置槽內(nèi)。
進一步，所述細(xì)胞消化液存儲元件包括細(xì)胞消化液放置槽與細(xì)胞消化液瓶，所述細(xì)胞消化液瓶放置在所述細(xì)胞消化液放置槽內(nèi)。
進一步，所述臍帶洗滌液存儲元件包括臍帶洗滌液放置槽與臍帶洗滌液瓶，所述臍帶洗滌液瓶放置在所述臍帶洗滌液放置槽內(nèi)。
進一步，所述臍帶采集保存液存儲元件包括臍帶采集保存液放置槽與臍帶采集保存液瓶，所述臍帶采集保存液瓶放置在所述臍帶采集保存液放置槽內(nèi)。
進一步，所述細(xì)胞凍存液存儲元件包括細(xì)胞凍存液放置槽與細(xì)胞凍存液瓶，所述細(xì)胞凍存液瓶放置在所述細(xì)胞凍存液放置槽內(nèi)。
本實用新型的有益效果：
本實用新型的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴增試劑盒采用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，由于臍帶組織塊分格貼壁，可根據(jù)細(xì)胞游出時間先后，分批收集原代細(xì)胞進行傳代，最大限度使所有組織塊游離出間充質(zhì)干細(xì)胞，大大提高從每根臍帶獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量，且最終收獲凍存的細(xì)胞不僅數(shù)量大，而且純度很高，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果CD73、CD90、CD105分別都高于99％，CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR分別都低于1％，各批次細(xì)胞質(zhì)量保持穩(wěn)定。組織貼壁法從人臍帶中分離MSC并進行傳代培養(yǎng)，最終大量獲得MSC產(chǎn)品的試劑盒，克服了目前組織貼壁法獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量低的缺點。
附圖說明
為了更清楚地說明本實用新型實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本實用新型的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本實用新型臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴增試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖標(biāo)示：1、盒體，2、臍帶采集保存液放置槽，3、臍帶洗滌液放置槽，4、細(xì)胞培養(yǎng)板放置槽，5、細(xì)胞凍存液放置槽，6、細(xì)胞消化液放置槽，7、細(xì)胞洗滌液放置槽，8、細(xì)胞培養(yǎng)液放置槽，9、臍帶采集保存液瓶，10、臍帶洗滌液瓶，11、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12、細(xì)胞凍存液瓶，13、細(xì)胞消化液瓶，14、細(xì)胞洗滌液瓶，15、細(xì)胞培養(yǎng)液套裝。
具體實施方式
下面將結(jié)合本實用新型實施例中的附圖，對本實用新型實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本實用新型一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本實用新型中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本實用新型保護的范圍。
參照圖1，一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離和擴增試劑盒，包括盒體與盒蓋，盒體1內(nèi)設(shè)置有細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件、細(xì)胞洗滌液存儲元件、細(xì)胞消化液存儲元件、臍帶洗滌液存儲元件、臍帶采集保存液存儲元件、細(xì)胞存儲元件與細(xì)胞凍存液存儲元件。細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件位于盒體的右側(cè)，細(xì)胞洗滌液存儲元件、細(xì)胞消化液存儲元件、臍帶洗滌液存儲元件、臍帶采集保存液存儲元件、細(xì)胞存儲元件與細(xì)胞凍存液存儲元件均位于盒體的左側(cè)。細(xì)胞消化液存儲元件位于細(xì)胞洗滌液存儲元件上方。臍帶洗滌液存儲元件、臍帶采集保存液存儲元件、細(xì)胞存儲元件與細(xì)胞凍存液存儲元件均位于細(xì)胞消化液存儲元件上方。細(xì)胞凍存液存儲元件與細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件相鄰。細(xì)胞存儲元件位于臍帶采集保存液存儲元件與細(xì)胞凍存液存儲元件之間。臍帶洗滌液存儲元件位于臍帶采集保存液存儲元件與細(xì)胞消化液存儲元件之間。細(xì)胞存儲元件包括細(xì)胞培養(yǎng)板放置槽4與6孔細(xì)胞培養(yǎng)板11，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板11設(shè)置在細(xì)胞培養(yǎng)板放置槽4內(nèi)。
本實施例中，細(xì)胞培養(yǎng)液存儲元件包括細(xì)胞培養(yǎng)液放置槽8與細(xì)胞培養(yǎng)液套裝15，細(xì)胞培養(yǎng)液套裝15放置在細(xì)胞培養(yǎng)液放置槽8內(nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)液套裝15含低糖DMEM培養(yǎng)液450ml/套、胎牛血清50ml/套、250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液10ml/套。細(xì)胞洗滌液存儲元件包括細(xì)胞洗滌液放置槽7與細(xì)胞洗液瓶14，細(xì)胞洗滌液瓶14放置在細(xì)胞洗滌液放置槽7內(nèi)。細(xì)胞消化液存儲元件包括細(xì)胞消化液放置槽6與細(xì)胞消化液瓶13，細(xì)胞消化液瓶13放置在細(xì)胞消化液放置槽6內(nèi)。臍帶洗滌液存儲元件包括臍帶洗滌液放置槽3與臍帶洗滌液瓶10，臍帶洗滌液瓶10放置在臍帶洗滌液放置槽3內(nèi)。臍帶采集保存液存儲元件包括臍帶采集保存液放置槽2與臍帶采集保存液瓶9，臍帶采集保存液瓶9放置在臍帶采集保存液放置槽2內(nèi)。細(xì)胞凍存液存儲元件包括細(xì)胞凍存液放置槽5與細(xì)胞凍存液瓶12，細(xì)胞凍存液瓶12放置在細(xì)胞凍存液放置槽5內(nèi)。
本實施例中，臍帶采集保存液瓶9規(guī)格為100ml/瓶，共計1瓶。臍帶洗滌液瓶10規(guī)格為1000ml/瓶，共計1瓶。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板11共計5個。細(xì)胞凍存液瓶12規(guī)格為500ml/瓶，共計3瓶。細(xì)胞消化液瓶13規(guī)格為50ml/瓶，共計5瓶。細(xì)胞洗滌液瓶14規(guī)格為1000ml/瓶，共計5瓶。細(xì)胞培養(yǎng)液套裝15共計10套。
試劑盒的配制步驟及用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與擴增流程
一、試劑盒的配制
1)臍帶采集保存液配制及裝瓶：將青霉素、鏈霉素加入生理鹽水，終濃度分別是200單位/ml和200μg/ml，0.22μm過濾除菌，分裝到無菌密封瓶，每瓶100ml，貼上標(biāo)簽。
2)臍帶洗滌液配制及裝瓶：將青霉素、鏈霉素加入生理鹽水，終濃度分別是200單位/ml和200μg/ml，0.22μm過濾除菌，分裝到無菌密封瓶，每瓶500ml，貼上標(biāo)簽。
3)細(xì)胞洗滌液為無菌生理鹽水，裝入無菌密封瓶，貼上標(biāo)簽。
4)細(xì)胞消化液配制及裝瓶：稱取胰蛋白酶粉末溶于生理鹽水，胰蛋白酶終濃度是0.25％，0.22μm過濾除菌，分裝，每瓶50ml，貼上標(biāo)簽。
5)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液配制：低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液每瓶450ml、胎牛血清每支50ml、濃度為250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液每支10m，分別-20℃保存，使用前4℃過夜解凍，然后將三種成分混勻。
6)細(xì)胞凍存液配制：將細(xì)胞培養(yǎng)液、FBS、DMSO按1:3:1比例混合，輕輕混勻，分裝，貼標(biāo)簽
該試劑盒的規(guī)格為1次/盒，每盒中各組分的量為：臍帶采集保存液1瓶(100ml/瓶)，臍帶洗滌液1瓶(1000ml/瓶)，細(xì)胞消化液5瓶(50ml/瓶)，細(xì)胞洗滌液5瓶(1000ml/瓶)，細(xì)胞培養(yǎng)液10套(含低糖DMEM培養(yǎng)液450ml/套、胎牛血清50ml/套、250ng/ml bFGF和250ng/ml EGF混合液10ml/套)，細(xì)胞凍存液3瓶(500ml/瓶)，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板5個。按照上述試劑量對試劑盒中各組分進行分裝，包裝得到用于制備臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。試劑盒-20℃保存，有效期2年，使用之前4℃冰箱內(nèi)解凍之后4℃保存，一個月內(nèi)用完。
二、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
1)臍帶采集與運輸：取新生兒臍帶，保存于臍帶采集保存液中，24h內(nèi)送至實驗室。
2)洗滌臍帶：于超凈工作臺中取出臍帶，放入15cm無菌玻璃培養(yǎng)皿清洗臍帶3次，以去除血漬。
3)將臍帶剪成長約1cm的小段，剝?nèi)ネ饽ぃ埽玫饺A氏膠，用剪刀將Wharton膠剪成約1mm3大小。
4)將剪碎Wharton膠轉(zhuǎn)移到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板里，用鑷子將其鋪勻，放培養(yǎng)箱里，約3小時后，待組織塊牢固貼在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板以后，加入少量的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，剛好沒過組織塊。
5)連續(xù)兩三天都要觀察培養(yǎng)基的顏色，初步判斷有無污染，保持六孔板絕對靜止，切不可移動。
6)第7天左右，顯微鏡下觀察，會有細(xì)胞從組織塊周圍游離出來，待有大量細(xì)胞游離出以后，吸掉游離出細(xì)胞的組織塊。從有細(xì)胞開始爬出時開始，隔天半量換液一次。
7)第11天左右，早先游離出細(xì)胞的孔中會出現(xiàn)很多細(xì)胞集落，而且密度已較高，可準(zhǔn)備傳代；剩余未游離出細(xì)胞或者少量游離出細(xì)胞的孔可繼續(xù)培養(yǎng)，待有大量細(xì)胞游離出來并出現(xiàn)較多細(xì)胞集落時再傳代。通過分批傳代，可使絕大多數(shù)貼壁的臍帶Wharton膠組織塊都游離出細(xì)胞，顯著提高每根臍帶的細(xì)胞獲得量。
8)細(xì)胞傳代
①吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用細(xì)胞清洗液清洗6孔細(xì)胞培養(yǎng)板/培養(yǎng)瓶一次，加入細(xì)胞消化液，顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞變圓時，用培養(yǎng)液終止消化；
②用滴管輕輕吹打培養(yǎng)瓶/6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將液體轉(zhuǎn)移到離心管，1000rpm，離心7min，倒去上清。
③加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，傳入T75培養(yǎng)瓶，每瓶約5×105個細(xì)胞，15ml培養(yǎng)液(若使用T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞數(shù)及培養(yǎng)液按相應(yīng)量增加)，隔天換液，待細(xì)胞80％-90％融合時再次傳代。
9)細(xì)胞的凍存
①收集細(xì)胞：用細(xì)胞消化液消化第3代細(xì)胞,，培養(yǎng)液終止消化，轉(zhuǎn)移到離心管，計數(shù)，臺盼藍(lán)染色計算存活率，1000rpm離心7min，棄上清
②制成細(xì)胞凍存懸液：根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入適當(dāng)體積的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液和凍存液以1:1比例加在一起，細(xì)胞的終濃度在1～2×106個/ml，加凍存液時慢點，加一滴混勻后再加，以減少對細(xì)胞的刺激
③分裝：將細(xì)胞凍存懸液分裝到凍存管中，每管1ml
④逐步降溫凍存細(xì)胞：4度30分鐘→20度30分鐘→液氮罐口30min→下放懸吊在罐中但不接觸液面30min→液氮面30min→液氮中。
以上所述僅為本實用新型的較佳實施例而已，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。