本發明涉及一種干細胞培養的方法，尤其涉及一種臍帶間充質干細胞的培養方法，以建立間充質干細胞制取的規范化方法。

背景技術：

間充質干細胞用于臨床應用研究的種類主要是骨髓間充質干細胞和臍帶間充質干細胞，這兩類細胞都具有間充質干細胞共同的特點低免疫源性，特別是后者更為明顯。臍帶中組織結構簡單，除了主要的大血管，其余均以結締組織為主，造成了臍帶間充質干細胞基本未與抗原接觸，所以免疫源性很低，這極大的增加了臨床應用的可能性。臍帶來源的間充質干細胞不但能夠成為骨髓間充質干細胞的理想替代物，而且具有更大的應用潛能。已經有較多的報道關于臍帶間充質干細胞的制備。如何快速、有效地制備高品質的間充質干細胞用于臨床和科研是目前干細胞的熱點研究內容之一。由于受到技術水平所限，目前臍帶間充質干細胞制備仍處于實驗室小作坊式的方式制備，沒有具體的標準規范生產流程，難以滿足廣泛的需求。

間充質干細胞制品不同于一般的生物制品，它來源于新生嬰兒組織，生產制備過程涉及到組織的處理、原初代細胞的分離培養、細胞傳代培養、冷凍保存、運輸、復蘇等臨床應用前的程序，最終的間充質干細胞的產品不是某一單一或復合的物質，而是一群具有生物活性的細胞。

國家頒布的《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則(試行)》，是遵循科學性的原則，以風險控制為主的思路，參照中國藥典、WHO、歐盟、美國FDA及ICH有關細胞治療指導原則而制定的，既體現適用性的原則，又具有前瞻性。規定了干細胞的采集、分離及干細胞(系)的建立；規定了細胞制劑的制備要求；規定了干細胞制備的檢驗，包括基本原則、質量檢驗和放行檢驗規定了干細胞制劑的質量研究，應不斷地擴展對干細胞的安全性、有效性及穩定性研究，不斷地提高對干細胞制劑質量控制的技術能力。

干細胞制劑的制備工藝包括干細胞的采集、分離、純化、擴增和傳代，干細胞(系)的建立、向功能性細胞定向分化，培養基、輔料和包材的選擇標準及使用，細胞凍存、復蘇、分裝和標記，以及殘余物去除等。本方法根據《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則(試行)》的規定及精神，不斷地優化臍帶間充質干細胞的工藝過程，建立了臍帶間充質干細胞制備及質量控制的全過程的規范化、標準化的制備生產程序，從整個生產鏈上的保證臍帶間充質干細胞在細細胞數量、細胞活性、生物功能的效應和穩定、安全性及質量可控性。

目前的臍帶間充質干細胞的標準制備生產未見報道，其報道的相關文章也僅限于試驗階段，沒有形成規范化、標準化的工藝流程。有研究建立了充分利用組織塊的方法：采集足月剖宮產分娩胎兒臍帶，采用不剝離血管和包膜組織貼壁法培養臍帶間充質干細胞，待原代細胞長出時，收集原本換液應丟棄的組織塊，進行二次貼壁培養，如此反復，待二次組織科長出細胞時，收集組織塊進行三次貼壁培養。僅對三次貼壁培養長出的第三代細胞進行生物學分析(西南國防醫藥，2015，25(8)：828～831)。

組織塊貼壁法是沿臍靜脈內腔縱向切開血管，剝離臍靜脈內膜，將剝離處的組織切成小塊放在MSC培養液中，置于37℃，5v/v％CO₂培養箱培養，約5天～7天后可見貼壁生長的單個長條梭形細胞從組織中爬出，15天左右取貼塊即可獲得MSC。此法周期較長，增加了間充質干細胞在非人體單一的環境發生突變的幾率，收獲的原代細胞量少，且不能充分地利用組織，制備過程也限于實驗室，非批量制備。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種制備臍帶間充質干細胞的方法，以實現排除臍帶個體差異性的影響，使得臍帶間充質干細胞生產工藝全過程能夠標準化、規范化、程序化，產品能被質量管理體系所控制。

一種制備臍帶間充質干細胞的方法，包括如下步驟：

步驟1：按規范采集初生嬰兒廢棄臍帶和臍帶血，在距胎兒臍部近處3cm～5cm處用兩把止血鉗夾住，從中間剪斷臍帶，收集自斷臍處至胎盤末端，將臍帶放入含有保養液的密閉容器內；

步驟2：在安全穩定的環境下運輸，運輸過程中不能直接和外界空氣有接觸，保證臍帶在24小時內到達實驗室；

步驟3：按采集規范接收、登記建立檔案，對采集的臍帶血進行人源特定病毒(包括：HIV、HBV、HCV、TP和CMV等)的檢測，保證臍帶安全可靠和溯源；

步驟4：48小時內用磷酸鹽緩沖液(含有青霉素10萬單位/L和鏈霉素100mg/L)洗去大部分殘留血液，保留10v/v％-20v/v％以上的殘留血液，進行碎化處理，獲得2mm³～5mm³均勻組織塊；

步驟5：0.2w/v％膠原酶II，37℃恒溫搖床上消化步驟4獲得碎化組織2小時；

步驟6：加入DMEM，采用分步離心法獲取臍帶間充質干細胞，棄去殘余組織。四步離心法的離心參數分別為：300rpm10min、1800rpm15min、1000rpm10min、1000rpm10min；

步驟7：將步驟6獲得的原初代臍帶間充質干細胞按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²接種于盛有培養基體系的塑料培養容器，培養基體系為含有10v/v％胎牛血清的LG-DMEM；置37℃，5v/v％CO₂培養箱培養，3天后換培養液，棄去非貼壁細胞，以后每2天更換培養液；

步驟8：5天～10天待細胞達到80％～90％融合度，利用胰蛋白酶和EDTA·4Na聯合消化法，輕輕吹打分散細胞；

步驟9：將步驟8獲得的細胞，按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度接種體外擴增。擴增臍帶間充質干細胞至需求的數量級，最多傳代擴增臍帶間充質干細胞到第六代(記為P6)；

步驟10：將步驟9獲得的間充質干細胞進行質量評估，包括細胞數量、細胞活性、細胞表面標記物(流式檢測CD34，CD45，CD73，CD90，CD105)、無菌檢測、支原體檢測。

步驟11：對評估合格的間充質干細胞加入冷凍保護劑，按包裝規格進行分裝；

步驟12：置MVE氣態液氮中保存。

本發明提供的制備臍帶間充質干細胞的方法用于建立臍帶間充質干細胞生產規范。所建立的臍帶間充質干細胞生產規范還包括建立標準、標準操作程序、質量管理體系建立和評估系統。

建立標準包括：建立采集標準、運輸標準、分離制備標準、凍存標準和入庫標準等；

標準操作程序包括：編寫標準操作程序(SOP)，制定采集、運輸、分離、傳代和擴增、分裝、凍存、復蘇、以及廢棄物處理等標準操作程序。

本發明技術方案實現的有益效果：

1.根據《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則(試行)》的規范，建立了標準化、規范化和程序化的臍帶間充質干細胞產品的生產工藝流程。

2.由于制備的規范化和標準化，采取定量的制備方法排除采集臍帶長度、粗細、色澤等個體差異性的影響，充分完全利用臍帶資源。

3.建立規范化、標準化的臍帶間充質干細胞的原代細胞分離和培養。

3.1優選出最適消化條件，0.2％膠原酶II、37℃恒溫搖床環境內消化2小時。

3.2根據分離過程中的離心目的，優選出4步離心分離法，離心參數分別為300rpm10min、1800rpm15min、1000rpm10min、1000rpm10min，提高了分離提取效果，獲得更多的原代間充質干細胞。

3.3優選出原代細胞5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²的種植密度于塑料培養容器中，較高的種植密度，順應間充質干細胞的貼壁生長特性，以保證提取的原初代臍帶間充質干細胞充分地貼壁生長。

4.建立標準化、規范化臍帶間充質干細胞傳代培養。

4.1優化出按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²接種于塑料培養容器。如果高于此濃度，細胞重疊，影響細胞貼壁生長，營養物質供給相對不足，代謝產物增加導致死細胞增加；如果低于此濃度，細胞融合時間長，細胞老化，不利于標準化規范化生產。

4.2由于在穩定條件下2～3天就傳代一次，控制在P5、P6的傳代次數，優選的體外擴增法縮短了培養周期，培養周期的縮短和傳代代數的控制，提高了間充質干細胞細胞臨床使用和研究的安全性。

附圖說明

圖1為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液進行流式細胞儀檢測，而得陰性對照散點圖；

圖2為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液進行流式細胞儀檢測，而得強表達散點圖；

圖3為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液，進行流式細胞儀檢測而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105陰性對照圖；

圖4為實施例1獲得P5代細胞制成細胞懸液，進行流式細胞儀檢測而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105強表達曲線圖。

具體實施方式

以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。

本發明以下實施例所用實際和儀器詳見如下表1，其它所用的試劑若未經說明，均購自康寧(Corning)公司。

表1

實施例1

1、按照標準采集初生嬰兒廢棄臍帶和臍帶血，采集需在經產婦知情同意情況下進行，在距胎兒臍部近處3cm～5cm處用兩把止血鉗夾住，從中間剪斷臍帶，收集自斷臍處至胎盤末端臍帶密封入含有保養液的臍帶采集容器；

2、參照SOP在安全穩定的環境下運輸，運輸過程中不能直接和外界空氣有接觸，保證臍帶在24小時內到達實驗室；

3、登記建立檔案，初檢臍帶，要求采集瓶無破損、采集液無色變、臍帶總體積≥30ml，對采集的臍帶血進行人源特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、TP和CMV等)的檢測；

4、48h內用緩沖液沖洗去除大部分殘留血液，保留10v/v％-20v/v％的殘留血液，緩沖液是采用含有1.00v/v％青霉素/鏈霉素的磷酸鹽緩沖液。碎化處理清洗后的臍帶，獲得2mm³～5mm³均勻組織塊。

5、0.2m/v％膠原酶II，37℃恒溫搖床上消化4.4步驟獲得碎化組織2小時；

6、加入洗脫液，采用離心法獲取臍帶間充質干細胞，棄去殘余組織。四步離心法分離出未提純人臍帶間充質干細胞，離心分離的參數分別為：300rpm10min、1800rpm15min、1000rpm10min、1000rpm10min；

7、將獲得的原初代臍帶間充質干細胞按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²接種于盛有培養基體系的塑料培養容器，培養基體系為含有10v/v％胎牛血清的LG-DMEM；置37℃，5v/v％CO₂培養箱培養，3天后換培養液，棄去非貼壁細胞，以后每2天更換培養液；

8、5～10天待細胞達到80％～90％融合度，利用胰蛋白酶和EDTA·4Na聯合消化法，結合生物化學消化方法和物理吹打方法分散細胞；

9、傳代培養步驟8獲得的細胞，按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度接種，擴增臍帶間充質干細胞至需求的數量級，最多傳代擴增臍帶間充質干細胞到P6代；

10、將步驟9獲得的間充質干細胞進行質量評估，包括細胞數量、細胞活性、細胞表面標記物(流式檢測CD34，CD45，CD73，CD90，CD105)、無菌檢測、支原體檢測。

11、對評估合格間充質干細胞進行分裝，不能立即使用的按照慢凍的規則降溫，置氣態液氮中保存(參見表2)。

取實施例1細胞臺盼藍拒染后，使用Life Technologies自動細胞計數儀進行計數分析。本法的得到的間充質干細胞活性，各代細胞拒染實驗活性均可達到97％～100％。

取實施例1細胞培養至P5細胞，用0.25w/w％胰酶消化，用PBS洗滌2～3次，制成1.0×10⁶的細胞懸液，流式檢測CD34、CD45、CD73、CD90和CD105(參見圖3和圖4)。用流式分析軟件Flow Jo進行分析，P5收獲時，強表達標記細胞達95％以上，不表達細胞小于2％(參見圖1和圖2)。

表2

實施例2

將實例1中步驟7中原初代臍帶間充質干細胞按5.0×10³/cm²～1.0×10⁴/cm²接種于盛有培養基體系的塑料培養容器對照成原初代臍帶間充質干細胞10.0×10⁶個按1.0×10⁴/cm²、5.0×10⁴/cm²、10.0×10⁴/cm²和20.0×10⁴/cm²接種于盛有培養基體系的塑料培養容器(參見表3)。

觀察細胞伸展時間、融合時間，記錄細胞培養容器使用個數，并比較接種密度的優缺點。實驗顯示：接種密度低融合時間長，培養時間過長細胞出現老化現象，耗材使用量大，工作量大。接種密度與融合時間呈反比，接種密度太高，細胞生長空間不夠喝營養不夠，不利于細胞的傳代擴增。綜合分析，選擇出原代細胞接種密度為5×10⁴/cm²～10.0×10⁴/cm²。

表3

實施例3

將實施例1中P1代細胞按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度接種對照成按1.0×10⁴/cm²、2.0×10⁴/cm²、3.0×10⁴/cm²和4.0×10⁴/cm²密度接種傳代，倒置顯微鏡下觀察臍帶間充質干細胞的貼壁時間，細胞形態，折光性，融合時間，細胞活率的差別(參見表4)。

表4

實施例4

將實施例1的步驟5 0.2v/v％膠原酶II，37℃恒溫搖床上消化步驟4獲得碎化組織2小時對照成膠原酶II濃度設置0.1v/v％、0.2v/v％和0.4v/v％三個梯度值，消化時間1小時、2小時和4小時三個時間段，共9個對照試驗(參見表5)。

實驗顯示膠原酶II濃度小、消化時間，消化不充分，獲得法的原初代臍帶間充質干細胞量少；膠原酶II濃度大、消化時間長雖能獲得足夠的原初代臍帶間充質干細胞，但對細胞造成損傷，使貼壁伸展時間延長，融合時間延長。通過實驗選擇出膠原酶II濃度0.2％，消化時間2小時作為臍帶組織塊的消化參數。

表5

實施例5

將實施例1中步驟6離心分離的參數分別為：10min 300rpm、15min 1,800rpm、1000rpm 10min和1000rpm 10min對照成離心參數(10min 300rpm、15min 1,800rpm、10min 1,000rpm和10min 1,000rpm)；(10min 500rpm、15min 1,800rpm、10min 1,000rpm和10min 1,000rpm)；(10min 300rpm、15min 1,500rpm、10min 1,000rpm和10min 1,000rpm)，以及(300rpm 10min、1,800rpm 15min、1,500rpm 10min和1,500rpm 10min)四個離心組合(參見表6)。

第一次離心后棄沉淀，留上層液，因提取的間充質干細胞在上層液中，嚴格控制離心力和時間，時間過長或離心力太大，提取的細胞將被沉淀丟棄；第二次離心是從第一次離心后的上層液中收集間充質干細胞，離心力過小或時間過短，細胞被丟棄，離心力過大或時間過長細胞受損，影響細胞的生長擴增；第三、四次洗滌離心，也是既要達到完全收集，也要最大地保持細胞活性。最終選擇出300r/min10分鐘、1,800r/min15分鐘、1,000r/min10分鐘和1,000r/min10分鐘的離心組合(離心機使用Thermo Scientific Sorvall ST 16系列離心機)。表6