本發明涉及一種干細胞制備的方法，尤其涉及一種完全利用臍帶資源制備間充質干細胞的方法，以提高對臍帶資源的利用效率。

背景技術：

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cell，MSCs)來源于發育早期的中胚層和外胚層，存在于全身結締組織和器官組織中，是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細胞。MSCs最初在骨髓中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而受到關注。由于MSCs在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌和內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷的修復。MSCs能分泌產生多種促進生長分化的細胞因子，包括TGF-β、EGF、SDF-1、HGF、VEGF和IL-6等細胞因子，具有免于調控功能。因此，其在生物工程和細胞治療等領域有廣闊的應用前景。

MSCs最初是在骨髓中發現的，后來發現臍帶、臍血、胎盤和其他一些組織也存在MSCs。但在成人骨髓中MSCs數量較少、容易被病毒感染、有較強的免疫原性等因素限制了其臨床應用。人臍帶來源的MSCs從細胞含量、細胞增殖能力、免疫原性低、取材方便等方面都優于骨髓MSCs。臍帶來源的MSCs是骨髓MSCs的理想替代物。從臍帶中提取間充質干使得臍帶能夠變廢為寶。

臍帶MSCs使用雖然無倫理學爭議，但臍帶采集是要通過醫院倫理委員會的批準，經產婦及其家屬知情同意后才能采集。

采集的臍帶長度、粗細、色澤、采集時間等個體差異的影響獲得的間充質干細胞的數量不一樣，細胞增殖能力也不一樣。

從臍帶中2條動脈和1條靜脈、包繞臍帶動靜脈的黏蛋白樣結締組織即為華通氏膠(Wharton’s Jelly)、臍帶靜脈內皮、內皮下層和血管周圍組織中都可以分離得到間充質干細胞。

間充質干細胞在體外分離和擴增時，添加一定濃度的胎牛血清以提供細胞生長必須的營養成份；提供結合蛋白、解毒作用；是細胞貼壁、鋪展在培養基質上所需因子來源；起緩沖液作用；提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。目前用人血清、血小板衍生物、血小板裂解液、血球裂解液和臍血清等加入間充質干細胞的培養體系中以提供更好的細胞增殖環境越來越受到研究者的關注。

細胞接種密度(Incxulum Density)在很大程度上影響細胞生長和生存。種濃度較低時，細胞生長繁殖較慢，最終的細胞產量也低，尤其是貼壁細胞，當接種濃度低到某一臨界值時，細胞甚至不會在介質面上擴展，也造成培養基的浪費。在臍帶間充質干細胞細胞體外培養過程中，尋找最適的細胞接種濃度，是得到穩定性好和產率高的干細胞產品的關鍵因素。

目前臍帶間充質干細胞獲得的方式常見有酶消化靜脈內膜法，Wharton’s Jelly組織貼壁法，膠原酶與胰酶聯合消化法。

酶消化靜脈內膜法：夾閉臍靜脈一端，灌入膠原膠酶，置于含雙抗的PBS中，37℃環境孵育0.5小時，收集酶液，用PBS反復灌洗，收集灌洗液，與酶液同時離心洗滌棄上清液后，以完全培養基重懸，接種培養，3天后全量換液，以后每周換液兩次，觀察貼壁生長情況。此方法操作繁瑣，初始獲得間充質干細胞數量級低，上皮細胞占比利高。

Wharton’s Jelly組織貼壁法：將臍帶置于含雙抗的PBS中，洗凈殘存血按血管螺旋走式剔除兩條動脈和一條靜脈，用有齒鑷剝開外包膜將Wharton’s Jelly撕下，用DPBS浸泡洗滌后，將臍帶組織剪碎至1mm³～3mm³大小，DPBS洗滌后，進行貼壁培養。一般約5-7天后可見貼壁生長的單個長條梭形細胞從組織中爬出，兩周取貼塊即可獲得MSCs。此方法分離的間充質干細胞的操作繁瑣，獲得的原代細胞時間長。

專利CN101608174 B公開了一種膠原酶與胰酶聯合消化法：將臍帶組織切成小塊置于膠原酶內消化，洗滌過濾后，以完全培養基重懸，接種培養，2天后換液棄非貼壁生長細胞，以后根據細胞生長匯合情況，使用含胰酶的洗脫液洗脫貼壁生長的細胞進行傳代換液。此法細胞收獲量高，保持細胞的生物原性，培養周期短。

技術實現要素：

本發明的另一個目的在于提供一種完全利用臍帶資源制備間充質干細胞的方法，以減小臍帶長度、粗細、色澤、采集時間、制備細胞增殖能力等個體差異的影響，獲得了更多的原代細胞數量。

一種完全利用臍帶資源制備間充質干細胞的方法，包括如下步驟：

步驟一，清洗去大部分臍帶的殘留血液，并保留動、靜脈內部10v/v％～2v/v％的殘留未凝固血液；

步驟二，將臍帶制成2mm³～5mm³大小組織碎塊(如：2.5mm³)，并用膠原酶II消化(如：加入2～3倍組織碎塊體積的0.2w/v％膠原酶II)；

步驟三，加入DMEM培養基進行300r/min10分鐘離心，完全提取殘剩組織碎塊和上層液交界的膠狀液體，收集上層液；

步驟四，上層液中再次加入洗脫液，重懸后1800r/min離心15分鐘；

步驟五，棄上層液后收集沉淀，加入洗脫液重懸，1000r/min離心10分鐘，重復清洗兩次，即獲得臍帶內部蘊含的間充質干細胞；

步驟六，將5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²獲得的原代臍帶間充質干細胞接種于含有10v/v％胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培養基中，混勻后置溫度37℃，CO₂濃度5v/v％二氧化碳培養箱培養，3天后第一次換完全培養基，棄去非貼壁細胞，以后每2天后更換完全培養基，待貼壁細胞融合率達到80％以上后消化分散貼壁細胞，按需求進行提純。

本發明的方法，使用緩沖液清洗去大部分臍帶的殘留血液，緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pH7.20，離子強度I＝0.05)含有青霉素10萬單位/L、鏈霉素100mg/L、3.00mmol/L還原型谷胱甘肽和2v/v％巰基乙醇。

本發明的方法，其消化分散的貼壁細胞，加入無血清冷凍保護劑進行分裝。

本發明的方法，其步驟二的利用恒溫搖床提高消化效率和穩定環境，獲得消化后組織殘剩組織碎塊和懸液混合物。

本發明技術方案實現的有益效果：

本發明提供的方法利用了全部采集臍帶制備臍帶間充質干細胞，充分利用有限的臍帶組織資源，減少造成不必要的浪費，增加了用于制備的組織體積，并且充分利用采集全部臍帶資源，最大程度上地提取具有有效生物活性的臍帶間充質干細胞，有利于高產地獲得臍帶內部蘊含間充質干細胞。

采用0.2w/v％膠原酶II消化，以及恒溫搖床的存在使Wharton’s Jelly及其它組織更為暴露，增大了組織和酶的接觸面積，在相同的時間內可以提高原代間充質干細胞的產率。

在緩沖液加入還原型谷胱甘肽和巰基乙醇，準確調節其pH值，新鮮配制以保持細胞外環境，避免或減少細胞的損害，增加細胞活性。

用緩沖液沖洗掉臍帶大部分殘留血液，保留10v/v％～20v/v％的殘留未凝固血液，培養系統中殘留血液可以提供外界無法獲得的微量血液因子，促進細胞生長，縮短臍帶間充質干細胞在非人體條件下的培養時間。

按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²接種細胞，促使細胞貼壁時間短、增殖速度快、生長形狀穩定、細胞成活率高，避免臍帶個體差異造成的細胞擴增的影響。

附圖說明

圖1A實施例1的P0代臍帶間充質干細胞生長進行鏡檢圖；

圖1B實施例1的P1代例臍帶間充質干細胞生長進行鏡檢圖；

圖2為實施例4的P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質干細胞的增殖曲線圖，圖中橫軸為細胞代數，縱軸為細胞數量；樣本1、樣本2和樣本3為三個平行細胞樣本隨著傳代；

圖3為實施例5部分利用臍帶與完全利用臍帶制備臍帶間充質干細胞數量對比圖；

圖4A為實施例1培養至P5代細胞制成細胞懸液進行流式細胞儀檢測，而得陰性對照散點圖；

圖4B為實施例1培養至P5代細胞制成細胞懸液進行流式細胞儀檢測，而得強表達散點圖；

圖5A為實施例1培養至P5代細胞制成細胞懸液，進行流式細胞儀檢測而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105陰性對照圖；

圖5B為實施例1培養至P5代細胞制成細胞懸液，進行流式細胞儀檢測而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105強表達曲線圖。

具體實施方式

以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。

本發明以下實施例所用實際和儀器詳見如下表1，其它所用的試劑若未經說明，均購自康寧(Corning)公司。

表1

本發明實施例臍帶間充質干細胞的制備方法如下：

實施例1

(1)配制臍帶清洗緩沖液：1.00v/v％青霉素/鏈霉素、3.00mmol/L還原型谷胱甘肽、2w/w％巰基乙醇的磷酸鹽緩沖液(pH7.20，I＝0.05)，青霉素/鏈霉素母液濃度為青霉素(10,000units/ml)/鏈霉素(10,000μg/ml)；

(2)按照國家規范采集初生嬰兒的臍帶，用清洗緩沖液沖洗除去臍帶內外大部分殘留血液(保留動靜脈內部10v/v～20v/v％的殘留未凝固血液)，全部剪碎獲得全部臍帶組織碎塊；

(3)向步驟(2)所獲得人臍帶組織中加入2～3倍組織體積的0.2w/v％膠原酶II消化處理，環境溫度37℃條件下消化2小時，利用恒溫搖床提高消化效率和穩定環境，獲得消化后組織殘剩組織碎塊和懸液混合物；

(4)加DMEM培養基于步驟(3)消化后的混合物內混勻，300r/min離心10分鐘；

(5)棄步驟(4)離心后沉淀，收集上層液，需完全提取殘剩組織碎塊和上層液交界的膠狀液體；

(6)步驟(5)獲得的上層液中加入洗脫液，重懸后1800r/min離心15分鐘；

(7)步驟(6)棄上層液后收集沉淀，加入組織塊洗脫液進行重懸，1000r/min離心10分鐘，重復上述步驟清洗兩次，即獲得臍帶內部蘊含的間充質干細胞；

(8)將步驟(7)得到的人臍帶間充質干細胞按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²濃度接種于盛有10v/v％FBS的LG-DMEM完全培養基的塑料培養容器中，混勻后置溫度37℃，CO₂濃度5v/v％二氧化碳培養箱培養。3天后第一次換完全培養基，棄去非貼壁細胞，以后每2天后更換完全培養基，待貼壁細胞融合率達到80％以上后按需求進行提純、消化分散貼壁細胞，加入無血清冷凍保護劑進行分裝。

表2

實施例2

將實施例1中步驟(2)用清洗緩沖液沖洗除去臍帶內外大部分殘留血液對照成清洗除去臍帶內外殘留的全部血液，取一案例結果如表3所示，相對于表2的結果，有著更長的生長周期和較少的的上東城數量。

表3

實施例3

將實施例1中步驟(2)剪碎獲得全部臍帶組織碎塊對照成剪碎獲得部分臍帶組織碎塊，取一案例結果如表4所示，相對于表2的結果制備數量減少，凍存數量較少。

表4

實施例4

將實施例1中步驟實驗于三例臍帶樣本，擴增至P5代。

實施例5

將實施例1中步驟實驗于三例臍帶樣本，得到制備原代間充質干細胞數量對照實例一制備數量。

取實施例1臍帶間充質干細胞生長進行鏡檢。剛分離的臍帶間充質干細胞細胞呈球形懸浮于培養液中，并混有一定的紅細胞。接種12小時～24小時內細胞貼壁并伸展，36h～48h后細胞貼壁伸展擴大并混有非成纖維形狀特征的雜細胞，細胞穿增殖后以梭形細胞為主，可見多角形、星形，折光性好(見圖1A)。原代臍帶間充質干細胞分布不勻的增殖細胞族，優選出的接種濃度在5d～7d便可達到80％以上的融合。傳代培養至P1代，傳代細胞仍以梭形為主，雜細胞逐漸減少，細胞比較均一，完全融合呈平行渦旋狀，較原代更大(見圖1B)。

取實施例1的P1代細胞利用臺盼藍拒染原理染色后，Life Technologies自動細胞計數儀進行計數分析。本發明方法得到的各代間充質干細胞細胞據拒染實驗活性均可達到97.00％～100.00％。

取實施例4的細胞P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質干細胞的增殖情況進行驗證(參見圖2)，由圖3可見，隨著傳代代數的增加，細胞數量呈倍數增加。理論上經過4次傳代為細胞原數量16倍，由于細胞會隨著代數增加而伸展延伸，實際P5時的細胞數量為P1的15倍左右。

取實施例5細胞經部分利用臍帶與完全利用臍帶制備臍帶間充質干細胞數量對比可見，由于充分利用臍帶，完全利用臍帶增大了制備源，較部分利用臍帶得到原代細胞多(參見圖3)

按實施例1培養至P5代細胞，分散成單個細胞后用PBS洗滌2次～3次，制成1.0×10⁶的細胞懸液，流式檢測CD34、CD45、CD73、CD90和CD105等5個表面標記物(參見圖5A和圖5B)。用流式分析軟件Flow Jo進行分析，傳代過程中間充質干細胞逐漸純化，雜細胞量越來越少。P5、P6收獲時，強表達標記細胞達95％以上，不表達細胞小于2％(參見圖4A和圖4B)，符合國家頒布標準要求，證明細胞的免疫表型非常穩定，保證了制備出的臍帶間充質干細胞細胞安全性。