本發明克隆表達了一種L-α-羥酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業微生物領域。

背景技術：

L-α-羥酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一種以FMN(FAD)為輔酶的脫氫酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties of crystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a long chain alpha-hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95to glycine.J Biol Chem.1996 8；271(45):28300-28305)。可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化L-乳酸生產丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)

目前為止，已經在惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，綠色氣球菌(Aerococcus viridians)，鏈球菌屬(Streptococcus sp.)，片球菌屬(Pediococcus sp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis),運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)和過氧化醋桿菌(Acetobacter peroxidans)等細菌中克隆表達得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中檢測到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。(Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，Applied Biochemistry and Microbiology,2007,43(2)178–181)

本發明首次從Carnimonas nigrificans中克隆表達出一種新型的L-α-羥酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(S)-α-羥酸，而且可以氧化(S)-α-羥酸酯，可應用于光學純(R)-α-羥酸酯和(R)-α-羥酸的制備。

技術實現要素：

本發明從Carnimonas nigrificans中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究。

本發明的技術方案如下：

1、菌株

本發明L-α-羥酸氧化酶基因的來源菌株為：Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78，購自美國ATCC菌種庫。

2、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

提取Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出L-α-羥酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。

3、L-α-羥酸氧化酶表達與純化

將重組質粒導入E.coli BL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、L-α-羥酸氧化酶的酶學性質分析

以L-乳酸為底物研究pH對本發明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

以L-乳酸為底物研究溫度對本發明所述L-α-羥酸氧化酶酶活的影響。

L-α-羥酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、L-對羥基苯乳酸、L-丹參素、L-扁桃酸。

酶活測定方法為：根據Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。

5、L-α-羥酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉化16h，轉化后液相色譜分析上清液。(S)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應的α-酮酸酯，(R)-α-羥酸酯不被氧化。

產物(R)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：

對映體過量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

(R)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_R為反應后(R)-對映體的峰面積，S_S為反應后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S₀為反應前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。

產物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發表明的有益之處：從Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78中克隆得到了一種L-α-羥酸氧化酶，該酶可以氧化(S)-α-羥酸和(S)-α-羥酸酯，可用于規模化制備手性純(R)-α-羥酸酯，具有重要的工業應用價值。

具體實施方式

實施例1

本實施例為本發明所述L-α-羥酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構建。

1、Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78DNA的提取

將Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78菌株在LB培養基中培養12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養基中，37℃培養至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉移到50mL預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、L-α-羥酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設計

設計引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAGTACTCCGCTAACTCCACGTC 3'

引物2：5'GCCGTCTAGACGTCCCGCGCCGATAG 3'

(2)PCR擴增

用以上合成的兩條引物，以Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78的基因組DNA為模板進行PCR擴增。

本步驟中擴增體系為：

擴增程序為：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應30個循環

72℃，10min

PCR產物送華大基因測序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質粒和PCR產物進行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉化到E.coli DH5α感受態細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態細菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養液，37℃培養1h使菌體復蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養24h長勢良好。挑單菌落進行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質粒。將重組質粒導入BL21大腸桿菌感受態中，保存備用。

實施例2

本實施例為本發明所述L-α-羥酸氧化酶的誘導表達及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養液中。37℃培養2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導培養24h。將發酵液進行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設置systemflow 20ml/min流速，進行排氣。然后設置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進結合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經冷凍干燥備用。

實施例3

本實施例為本發明所述L-α-羥酸氧化酶的最適溫度。以L-乳酸為底物，將底物與pH為5.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定L-α-羥酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應溫度為35℃。

實施例4

本實施例為本發明所述L-α-羥酸氧化酶的最適pH值。以L-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，35℃水浴15min測定酶的酶活，結果發現在pH 5.0條件下L-α-羥酸氧化酶酶活最高。

實施例5

本實施例為本發明所述L-α-羥酸氧化酶與不同底物的反應特性列于表2中。

表2 L-α-羥酸氧化酶對不同底物的活性

實施例6

根據發明內容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當在反應時間充分時，可以得到各類高光學純的(R)-α-羥酸酯，該酶的光學專一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種氧化酶及其應用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1188

<212> DNA

<213> Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78

<400> 1

atgagtactc cgctaactcc acgtcgcagc gatcaaaagc gttatctgaa tctggacgac 60

tacagcgcgg ctgcacagcg cctgttgcca cgggcgctgt tcgcctacgt ttcaggctcg 120

gcaggcgacg gtgaaacact ggctgcgaac cgcgatgcct tcaagcagtg ggcgctaata 180

ccgcagcagc tgcgcggcgt cgcttcacga agtgccgcca tcgagctact cggccagcgt 240

tttgccatgc cgattggcgt gtcggcattc ggcgcggcgg cggttttggg ctataacgct 300

gatatcgcga tggcggcagc ggcatataac gcaaatgtgc cttatcagct gagtgccaac 360

tccattacgc ccatggaaga ggtaatcaag gtgaatcccg aggcgtggtt cgccgcctat 420

ctgccagacg atgcagcgct gatcagaggc gttgtcgagc gcgttagcaa cgcaggcttc 480

aagactctgg taattacggt cgatgtgccg gtggctgccc gacgcgagcc ggaaacgcgg 540

gctggctacg ccatgccgtt caaggcatcg gcgcgcttgg ggtttgatat gctccgccat 600

ccgcgctggg tgctgagccg cttcactcgt accctgctgc ggcgcgggat tccgcacatt 660

gaaaacgtta ccccccagcg tggccccagt atctttgctt ccaacacagg gtcgatcggt 720

ggagcggcca acttcaactg ggacaatatt cgtgctattc gcgcacagtg gcccggcaag 780

ctgctgctga agggtattct ttccgaacgc gatgcgctaa cagcacagga gattggcgtc 840

gatggcgtga ttgtctcgaa tcatggcgcc cgtttaagcg attcatccat cacaccgctg 900

gaagccctgc caaacatccg cgcagcctgc cctgagctga cggttctgct cgatggcggc 960

gtgcggcgtg ccggggatgc gttaaaggcg atcgcgctgg gggcagatgg cgtgatgatt 1020

ggccgtccac tgttttacgc caccatcctt ggtggccggc gcggcctcgt tcatgcgctg 1080

catttgctga gcgcagaact ggatcgggag atgggctttc atggcttgct aaacgttaac 1140

gaagtacgtg aggaagatcg gctctatcgg cgcgggacgc ttgcctaa 1188

<210> 2

<211> 395

<212> PRT

<213> Carnimonas nigrificans ATCC BAA-78

<400> 2

Met Ser Thr Pro Leu Thr Pro Arg Arg Ser Asp Gln Lys Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Asn Leu Asp Asp Tyr Ser Ala Ala Ala Gln Arg Leu Leu Pro Arg Ala

20 25 30

Leu Phe Ala Tyr Val Ser Gly Ser Ala Gly Asp Gly Glu Thr Leu Ala

35 40 45

Ala Asn Arg Asp Ala Phe Lys Gln Trp Ala Leu Ile Pro Gln Gln Leu

50 55 60

Arg Gly Val Ala Ser Arg Ser Ala Ala Ile Glu Leu Leu Gly Gln Arg

65 70 75 80

Phe Ala Met Pro Ile Gly Val Ser Ala Phe Gly Ala Ala Ala Val Leu

85 90 95

Gly Tyr Asn Ala Asp Ile Ala Met Ala Ala Ala Ala Tyr Asn Ala Asn

100 105 110

Val Pro Tyr Gln Leu Ser Ala Asn Ser Ile Thr Pro Met Glu Glu Val

115 120 125

Ile Lys Val Asn Pro Glu Ala Trp Phe Ala Ala Tyr Leu Pro Asp Asp

130 135 140

Ala Ala Leu Ile Arg Gly Val Val Glu Arg Val Ser Asn Ala Gly Phe

145 150 155 160

Lys Thr Leu Val Ile Thr Val Asp Val Pro Val Ala Ala Arg Arg Glu

165 170 175

Pro Glu Thr Arg Ala Gly Tyr Ala Met Pro Phe Lys Ala Ser Ala Arg

180 185 190

Leu Gly Phe Asp Met Leu Arg His Pro Arg Trp Val Leu Ser Arg Phe

195 200 205

Thr Arg Thr Leu Leu Arg Arg Gly Ile Pro His Ile Glu Asn Val Thr

210 215 220

Pro Gln Arg Gly Pro Ser Ile Phe Ala Ser Asn Thr Gly Ser Ile Gly

225 230 235 240

Gly Ala Ala Asn Phe Asn Trp Asp Asn Ile Arg Ala Ile Arg Ala Gln

245 250 255

Trp Pro Gly Lys Leu Leu Leu Lys Gly Ile Leu Ser Glu Arg Asp Ala

260 265 270

Leu Thr Ala Gln Glu Ile Gly Val Asp Gly Val Ile Val Ser Asn His

275 280 285

Gly Ala Arg Leu Ser Asp Ser Ser Ile Thr Pro Leu Glu Ala Leu Pro

290 295 300

Asn Ile Arg Ala Ala Cys Pro Glu Leu Thr Val Leu Leu Asp Gly Gly

305 310 315 320

Val Arg Arg Ala Gly Asp Ala Leu Lys Ala Ile Ala Leu Gly Ala Asp

325 330 335

Gly Val Met Ile Gly Arg Pro Leu Phe Tyr Ala Thr Ile Leu Gly Gly

340 345 350

Arg Arg Gly Leu Val His Ala Leu His Leu Leu Ser Ala Glu Leu Asp

355 360 365

Arg Glu Met Gly Phe His Gly Leu Leu Asn Val Asn Glu Val Arg Glu

370 375 380

Glu Asp Arg Leu Tyr Arg Arg Gly Thr Leu Ala

385 390 395