本發(fā)明克隆表達了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質(zhì)和應用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產(chǎn)丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)
目前為止，已經(jīng)在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發(fā)現(xiàn)了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)
本發(fā)明首次從痰塔特姆氏菌(Tatumella ptyseos)中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應相比逆反應極微弱，可應用于光學純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明從痰塔特姆氏菌(Tatumella ptyseos)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關(guān)的酶學特性，并進行了應用研究。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
1、菌株
本發(fā)明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Tatumella ptyseos ATCC 33301，購自美國ATCC菌種庫。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Tatumella ptyseos ATCC 33301菌體基因組總DNA。設(shè)計特異性引物，應用PCR方法，擴增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構(gòu)建重組質(zhì)粒。
3、D-乳酸氧化酶表達與純化
將重組質(zhì)粒導入E.coli BL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。
4、D-乳酸氧化酶的酶學性質(zhì)分析
以D-乳酸為底物研究pH對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。
以D-乳酸為底物研究溫度對本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。
D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。
酶活測定方法為：根據(jù)Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯
拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉(zhuǎn)化16h，轉(zhuǎn)化后液相色譜分析上清液。(R)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應的α-酮酸酯，(S)-α-羥酸酯不被氧化。
產(chǎn)物(S)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：
對映體過量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR為反應后(R)-對映體的峰面積，SS為反應后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S0為反應前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。
產(chǎn)物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。
所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯。
所述的α-羥酸酯，根據(jù)中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本發(fā)表明的有益之處：從Tatumella ptyseos ATCC 33301中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶可以氧化(R)-α-羥酸和(R)-α-羥酸酯，可用于規(guī)模化制備手性純(S)-α-羥酸酯，具有重要的工業(yè)應用價值。
具體實施方式
實施例1
本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構(gòu)建。
1、Tatumella ptyseos ATCC 33301DNA的提取
將Tatumella ptyseos ATCC 33301菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。
2、大腸桿菌感受態(tài)制備
(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養(yǎng)過夜。
(2)按1％接種量接種于50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.6(約2～3h)。
(3)將菌液轉(zhuǎn)移到50mL預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。
(4)棄上清，加入5mL預冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復2次。
(5)棄上清，加入1.5mL預冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物設(shè)計
設(shè)計引物序列為：
引物1：5'GCCGGGATCCATGAATAACCGTCAGGAGCTGACC 3'
引物2：5'GCCGTCTAGATTACTTGCCCCAGAATTTTTTACGG 3'
用以上合成的兩條引物，以Tatumella ptyseos ATCC 33301的基因組DNA為模板進行PCR擴增。
本步驟中擴增體系為：
擴增程序為：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應30個循環(huán)
72℃，10min
PCR產(chǎn)物送華大基因測序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據(jù)該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)雙酶切和連接
將pColdⅡ質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。
(4)轉(zhuǎn)化
步驟：
1在連接體系中加入100μl DH5α感受態(tài)細菌，輕混勻，冰浴30min。
2放入預熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復蘇。
5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。
6培養(yǎng)24h長勢良好。挑單菌落進行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導入BL21大腸桿菌感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例2
本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的誘導表達及分離純化。
1、加500μl重組菌液到50ml LB培養(yǎng)液中。37℃培養(yǎng)2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導培養(yǎng)24h。將發(fā)酵液進行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統(tǒng)操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設(shè)置system flow 20ml/min流速，進行排氣。然后設(shè)置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進結(jié)合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經(jīng)冷凍干燥備用。
實施例3
本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適溫度。以D-乳酸為底物，將底物與pH為6.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定D-乳酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應溫度為45℃。
實施例4
本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶的最適pH值。以D-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，45℃水浴15min測定酶的酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH 6.0條件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
實施例5
本實施例為本發(fā)明所述D-乳酸氧化酶與不同底物的反應特性，列于表2中。
表2D-乳酸氧化酶對不同底物的活性
實施例6
根據(jù)發(fā)明內(nèi)容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結(jié)果如下表所示：
表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果
由上表可以看出，當在反應時間充分時，可以得到各類高光學純的(S)-α-羥酸酯，該酶的光學專一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大學
<120> 一種氧化酶及其應用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1698
<212> DNA
<213> Tatumella ptyseos ATCC 33301
<400> 1
atgaataacc gtcaggagct gacccgcaag ctgcacgaaa tcgcgggaga aaaacaggtt 60
ttactgagtg aagacgataa ggccttttac accaaaggat tccgcgtcgg tcagggtgaa 120
gcactggccg tggtactgcc acagacgctg ttacagctct ggcaattgtt agaagtttgt 180
gttgccgaag atgttatcat tctgatgcag gcctccaata ccggcgtcac cggaggttca 240
accccggacg gtaatgatta cgaccgcgat attgtcatta tcagcacccg tttactgacc 300
ggggttcagg tcattgatga tcaccaacag gttatcgctt ttccgggcac gaccctcacc 360
gagcttgaag acaccctgaa gcctctgcag cgtgaacccc attcggtgat cggttcctcc 420
tgtatcggcg cgtctgtcat tggcgggtta tgtaataact ccgggggctc gctgatccgt 480
cgtggtccgg catttacaga aaaatcgctg tttgcccgca ttactgatga cggacatctt 540
gaactggtta accatctggg tattgagctg ggcgatactc cggagaggat cattaatgcg 600
ctggagacac gcgaatacac gaccggcgat gctgccgact ggcagggtaa aatctgggca 660
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gataaacgtt atctgtatga cagtgcggga tgtgccggaa aagtggtcgt ctttgccgca 780
cgtttgccga cgtttgccgc cagcgaagct acccgtacct tctatatcgg cagcaatgat 840
gaaagcgaac tgatcggttt acgccgtttt ctgctggaaa aaatggatga actgccctta 900
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tatctggcca tccgtaagct ggggccgcag gccattcccg gtttaatggc caacaaagcg 1020
cgctgggatg tgcggatcag acatgcccgt tttctgccgc ataattttac cgataagctg 1080
atccagggct ttaatcagat aaccccctcg tttatcgcac cgcggatcat ggattaccgc 1140
cggcgctttg tgcaccatct gatgattaaa attgaagccc gtcaggctga acaactgacg 1200
gcattgcttg aggagtattt cagccagcgt ccgggggaat atttcctgtg cgatgaccgg 1260
gaagctgccg atgcctttct gatccgtttc gcggtgggcg gctgtaccat ctcctactgt 1320
gactacctcg gctatgatac caaccagcga ttaattgctt ttgacgtggc tctgcgccgt 1380
aatgatgacc agtggcggat ccatctgcca cctcatcttg cggcgcaggt ccaggccgat 1440
tcctgttgcg ggcatttctt ttgctttgtg aaccaccagg attacgtcct taaagccggg 1500
gtggatgcga agaaattcaa acaggaggtg atggagtatc tggaacagcg tggtgcccgc 1560
tatcctgcgg agcacaatgt cgggcacctg tatcaggcgt cctgtgaaca tgaacaacac 1620
tggcgtgaac tggatccgac caatacctgc aacccgggga ttgggaaaac cagccgtaaa 1680
aaattctggg gcaagtaa 1698
<210> 2
<211> 565
<212> PRT
<213> Tatumella ptyseos ATCC 33301
<400> 2
Met Asn Asn Arg Gln Glu Leu Thr Arg Lys Leu His Glu Ile Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Gln Val Leu Leu Ser Glu Asp Asp Lys Ala Phe Tyr Thr Lys
20 25 30
Gly Phe Arg Val Gly Gln Gly Glu Ala Leu Ala Val Val Leu Pro Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Gln Leu Trp Gln Leu Leu Glu Val Cys Val Ala Glu Asp
50 55 60
Val Ile Ile Leu Met Gln Ala Ser Asn Thr Gly Val Thr Gly Gly Ser
65 70 75 80
Thr Pro Asp Gly Asn Asp Tyr Asp Arg Asp Ile Val Ile Ile Ser Thr
85 90 95
Arg Leu Leu Thr Gly Val Gln Val Ile Asp Asp His Gln Gln Val Ile
100 105 110
Ala Phe Pro Gly Thr Thr Leu Thr Glu Leu Glu Asp Thr Leu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys Ile Gly Ala
130 135 140
Ser Val Ile Gly Gly Leu Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser Leu Ile Arg
145 150 155 160
Arg Gly Pro Ala Phe Thr Glu Lys Ser Leu Phe Ala Arg Ile Thr Asp
165 170 175
Asp Gly His Leu Glu Leu Val Asn His Leu Gly Ile Glu Leu Gly Asp
180 185 190
Thr Pro Glu Arg Ile Ile Asn Ala Leu Glu Thr Arg Glu Tyr Thr Thr
195 200 205
Gly Asp Ala Ala Asp Trp Gln Gly Lys Ile Trp Ala Asp Asp Tyr Ser
210 215 220
Glu Gln Leu Arg Asp Thr His Ala Ala Ser Pro Ala Arg Phe Asn Gly
225 230 235 240
Asp Lys Arg Tyr Leu Tyr Asp Ser Ala Gly Cys Ala Gly Lys Val Val
245 250 255
Val Phe Ala Ala Arg Leu Pro Thr Phe Ala Ala Ser Glu Ala Thr Arg
260 265 270
Thr Phe Tyr Ile Gly Ser Asn Asp Glu Ser Glu Leu Ile Gly Leu Arg
275 280 285
Arg Phe Leu Leu Glu Lys Met Asp Glu Leu Pro Leu Gln Ala Glu Tyr
290 295 300
Ile His Ala Gly Ala Phe Asp Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Lys His Met
305 310 315 320
Tyr Leu Ala Ile Arg Lys Leu Gly Pro Gln Ala Ile Pro Gly Leu Met
325 330 335
Ala Asn Lys Ala Arg Trp Asp Val Arg Ile Arg His Ala Arg Phe Leu
340 345 350
Pro His Asn Phe Thr Asp Lys Leu Ile Gln Gly Phe Asn Gln Ile Thr
355 360 365
Pro Ser Phe Ile Ala Pro Arg Ile Met Asp Tyr Arg Arg Arg Phe Val
370 375 380
His His Leu Met Ile Lys Ile Glu Ala Arg Gln Ala Glu Gln Leu Thr
385 390 395 400
Ala Leu Leu Glu Glu Tyr Phe Ser Gln Arg Pro Gly Glu Tyr Phe Leu
405 410 415
Cys Asp Asp Arg Glu Ala Ala Asp Ala Phe Leu Ile Arg Phe Ala Val
420 425 430
Gly Gly Cys Thr Ile Ser Tyr Cys Asp Tyr Leu Gly Tyr Asp Thr Asn
435 440 445
Gln Arg Leu Ile Ala Phe Asp Val Ala Leu Arg Arg Asn Asp Asp Gln
450 455 460
Trp Arg Ile His Leu Pro Pro His Leu Ala Ala Gln Val Gln Ala Asp
465 470 475 480
Ser Cys Cys Gly His Phe Phe Cys Phe Val Asn His Gln Asp Tyr Val
485 490 495
Leu Lys Ala Gly Val Asp Ala Lys Lys Phe Lys Gln Glu Val Met Glu
500 505 510
Tyr Leu Glu Gln Arg Gly Ala Arg Tyr Pro Ala Glu His Asn Val Gly
515 520 525
His Leu Tyr Gln Ala Ser Cys Glu His Glu Gln His Trp Arg Glu Leu
530 535 540
Asp Pro Thr Asn Thr Cys Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser Arg Lys
545 550 555 560
Lys Phe Trp Gly Lys
565