本發明克隆表達了一種D-乳酸氧化酶，并公開了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶學性質和應用，屬于工業微生物領域。

背景技術：

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一種以FAD(FMN)為輔酶的α-羥酸氧化酶(習慣上均稱之為D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物傳感器中測定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生產丙酮酸。也有被用于光學純α-羥酸的制備(中國專利201210109290.4)

目前為止，已經在遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda)和運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)等中發現了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)

本發明首次從分散泛菌(Pantoea dispersa)中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶不僅可以氧化(R)-α-羥酸，而且可以氧化(R)-α-羥酸酯，該反應與NAD(NADP)為輔酶的乳酸脫氫酶參與的反應相比逆反應極微弱，可應用于光學純(S)-α-羥酸酯和(S)-α-羥酸的制備。

技術實現要素：

本發明從分散泛菌(Pantoea dispersa)中克隆得到了一種以FAD為輔酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大腸桿菌工程菌異源表達，公開了其相關的酶學特性，并進行了應用研究。

本發明的技術方案如下：

1、菌株

本發明D-乳酸氧化酶基因的來源菌株為：Pantoea dispersa ATCC 14593，購自美國ATCC菌種庫。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Pantoea dispersa ATCC 14593菌體基因組總DNA。設計特異性引物，應用PCR方法，擴增出D-乳酸氧化酶基因全長編碼框序列。并構建重組質粒。

3、D-乳酸氧化酶表達與純化

將重組質粒導入E.coli BL21(DE3)中，誘導表達。菌體破碎后得到粗酶液，純化后冷凍干燥備用。

4、D-乳酸氧化酶的酶學性質分析

以D-乳酸為底物研究pH對本發明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

以D-乳酸為底物研究溫度對本發明所述D-乳酸氧化酶酶活的影響。

D-乳酸氧化酶的底物特異性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-對羥基苯乳酸、D-酒石酸、D-蘋果酸、D-扁桃酸、D-丹參素。

酶活測定方法為：根據Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法進行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羥酸酯

拆分α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法為：取純化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羥酸酯5mM的pH 7的磷酸鹽緩沖液中，于30℃，150rpm水浴搖床中轉化16h，轉化后液相色譜分析上清液。(R)-α-羥酸酯中的α-羥基被脫氫氧化成對應的α-酮酸酯，(S)-α-羥酸酯不被氧化。

產物(S)-α-羥酸酯的光學純度通過對映體過量值(％e.e)來評價：

對映體過量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R為反應后(R)-對映體的峰面積，S_S為反應后(S)-對映體的液相色譜峰面積，S₀為反應前(R)-和(S)-對映體的液相色譜峰面積之和。

產物測定液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測波長210nm，進樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對羥基苯乳酸冰片酯、對羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細辛醇酯、對羥基苯乳酸細辛醇酯。

所述的α-羥酸酯，根據中國專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發表明的有益之處：從Pantoea dispersa ATCC 14593中克隆表達出一種新型的D-乳酸氧化酶，該酶可以氧化(R)-α-羥酸和(R)-α-羥酸酯，可用于規模化制備手性純(S)-α-羥酸酯，具有重要的工業應用價值。

具體實施方式

實施例1

本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆與大腸桿菌工程菌構建。

1、Pantoea dispersa ATCC 14593DNA的提取

將Pantoea dispersa ATCC 14593菌株在LB培養基中培養12h，12,000rmp/min離心10min得到菌體，應用細菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌體基因組總DNA，放冰箱備用。

2、大腸桿菌感受態制備

(1)接種E.coli DH5α和BL21(DE3)分別于含有20mL LB培養基的250mL搖瓶中，37℃、200rpm/min培養過夜。

(2)按1％接種量接種于50mL LB培養基中，37℃培養至OD₆₀₀約0.6(約2～3h)。

(3)將菌液轉移到50mL預冷的離心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃離心5min。

(4)棄上清，加入5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌體懸浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃離心5min。重復2次。

(5)棄上清，加入1.5mL預冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，輕輕懸浮菌體，然后按每個離心管(1.5mL)加入100μL菌液分裝，-70℃冰箱保藏備用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物設計

設計引物序列為：

引物1：5'GCCGGGATCCATGAATAACAACACCTCACACCCTG 3'

引物2：5'GCCGTCTAGATTTCACCGCCCAGCCTTTG 3'

(2)PCR擴增

用以上合成的兩條引物，以Pantoea dispersa ATCC 14593的基因組DNA為模板進行PCR擴增。

本步驟中擴增體系為：

擴增程序為：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反應30個循環

72℃，10min

PCR產物送華大基因測序后得到該酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根據該基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)雙酶切和連接

將pColdⅡ質粒和PCR產物進行雙酶切，酶切體系為：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，無菌水2μl共30μl。37℃水浴下雙酶切1h。將DNA片段克隆到pColdⅡ載體上，并轉化到E.coli DH5α感受態細胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，載體DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，無菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下連接12h-16h。

(4)轉化

步驟：

1在連接體系中加入100μl DH5α感受態細菌，輕混勻，冰浴30min。

2放入預熱的42℃水浴中，放置90s進行熱休克處理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培養液，37℃培養1h使菌體復蘇。

5將菌體均勻涂布在含抗生素的LB平板上。

6培養24h長勢良好。挑單菌落進行菌落PCR，核酸電泳驗證，提取重組質粒。將重組質粒導入BL21大腸桿菌感受態中，保存備用。

實施例2

本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶的誘導表達及分離純化。

1、加500μl重組菌液到50ml LB培養液中。37℃培養2.5h，15℃下靜置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷誘導培養24h。將發酵液進行離心(8000rmp/min，10min)得到菌體，用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液(20mmol/L，pH 7.0)復溶菌體，超聲破碎儀破碎，離心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。

2、將步驟1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白純化系統操作進行鎳柱純化，洗脫方法為：將A1、A2、B1、B2四根管路都放進水里，設置system flow 20ml/min流速，進行排氣。然后設置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均勻流出后裝柱子，平衡十分鐘之后把A1放進結合液中，B1放進洗脫液中，再進行排氣一次，平衡二十分鐘，然后上樣粗酶液，用500mM的高濃度咪唑緩沖液(B1所處溶液)梯度洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來得到純化的酶。純化后的酶經冷凍干燥備用。

實施例3

本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶的最適溫度。以D-乳酸為底物，將底物與pH為4.0的磷酸緩沖液在30-60℃不同的溫度條件下水浴15min，測定D-乳酸氧化酶的酶活，確定酶的最適反應溫度為40℃。

實施例4

本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶的最適pH值。以D-乳酸為底物，將底物在pH 3-9，40℃水浴15min測定酶的酶活，結果發現在pH 4.0條件下D-乳酸氧化酶酶活最高。

實施例5

本實施例為本發明所述D-乳酸氧化酶與不同底物的反應特性，列于表2中。

表2 D-乳酸氧化酶對不同底物的活性

實施例6

根據發明內容中的方法拆分各種外消旋α-羥酸酯，結果如下表所示：

表3拆分各種外消旋α-羥酸酯的效果

由上表可以看出，當在反應時間充分時，可以得到各類高光學純的(S)-α-羥酸酯，該酶的光學專一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種氧化酶及其應用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1710

<212> DNA

<213> Pantoea dispersa ATCC14593

<400> 1

atgaataaca acacctcaca ccctgccctg ctgtccgagc tgcgccgtct ggtcggcgcg 60

tcacagctgc tgaccgacgc agagcaaacc gcgcgctatc gtaagggttt ccgttccggc 120

gagggcgatg cgctggcggt ggttttcccc ggctcgctgc tggagctatg gcgcgtactg 180

caggcgctgg tacaggccga tgccatcgtg ctgatgcagg ccgccaatac cggcctgacc 240

gaaggttcaa cgcccaacgg caacgattac gatcgcccgg tggtgatcat cagtaccctg 300

cgtctcgaca aactgcagct gatcgacggc ggcaggcaga ttctcgcctt ccccggcagc 360

acgctgtatc agctggagaa aacccttaaa ccgctcgggc gcgagccgca ctcggtgatt 420

ggctcctcgt gcatcggcgc ctcggtgctg ggcggcatct gcaataactc cggcggctcg 480

ctgatcaaac gcggcccggc ctacagcgaa atggcgctgt ttgcacaggt ggacgccgac 540

ggcaagctcc ggctggtcaa ccatctgggc attgacctcg gtcattcgcc ggaagagatt 600

ctcggccggc tggacgatga gcgctggcag ccggatgatg tacgctggga tgcgcgccac 660

gcgtccgacc acgaatacgc cgagcgggtg cgggacattc atgccgatac gccggcgcgt 720

ttcaacgccg accagcggcg cctgtttgag gcgtcaggct gcgccggcaa actggcggtg 780

tttgccgtgc ggctcgacac cttccccacc gagccgaagc agcaggtgtt ttacattggc 840

accaacgacc cggcgacgct cggcgagctg cgtcgccaca tactggcgga gtttacccat 900

ttaccggtcg ccggtgagta catgcaccgc gatattttcg acatcgccga ggtctacggc 960

aaagacacct ttgtgatgat tgataaactc ggcaccgaca agatgccact gtttttcacc 1020

ctcaaaggcc gggtggatgc ctggctcagc aagctgagct tcgttaagcc gcacctgacc 1080

gatcgcctgc tgcaacgcat cagccgctgg ttcccggcgc acctgccgaa gcgcctgaag 1140

cagtatcgtg acaaatacga gcaccacctg atgctgaaga tgtctggcga cggcgtggcc 1200

gaagcgcagg cgtatctgca ggagtatttc cgcgaaggcg gtggtgagtt ctttgcctgc 1260

gacgccaaag agggcgcgca cgcctttttg catcgttttg ccgcagccgg tgccgccgtg 1320

cgctatcacg cggtgcacgc tgacgaagtg gaggatattc tggcgctgga cattgcgctg 1380

cgccgcaacg atcaggagtg gtttgagcgc ctgccgccgg agtttgataa cgatctgatt 1440

catcgccttt actacggcca cttcttctgc catgtgttcc atcaggatta cattgtgaag 1500

aaaggcgtag atgcccatgc gctgaaggag aagatgctgg cgatcctcgc ggcgcgcggc 1560

gcggagtatc cggcagagca taacgttggc catctgtatg cggccaaacc gcagctgcag 1620

gcgttttacc gccagctcga tccgaccaat acctttaacc cgggcatcgg gaaaaccagt 1680

aagcacaaag gctgggcggt gaaagcctga 1710

<210> 2

<211> 569

<212> PRT

<213> Pantoea dispersa ATCC14593

<400> 2

Met Asn Asn Asn Thr Ser His Pro Ala Leu Leu Ser Glu Leu Arg Arg

1 5 10 15

Leu Val Gly Ala Ser Gln Leu Leu Thr Asp Ala Glu Gln Thr Ala Arg

20 25 30

Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Glu Gly Asp Ala Leu Ala Val Val

35 40 45

Phe Pro Gly Ser Leu Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Gln Ala Leu Val

50 55 60

Gln Ala Asp Ala Ile Val Leu Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly Leu Thr

65 70 75 80

Glu Gly Ser Thr Pro Asn Gly Asn Asp Tyr Asp Arg Pro Val Val Ile

85 90 95

Ile Ser Thr Leu Arg Leu Asp Lys Leu Gln Leu Ile Asp Gly Gly Arg

100 105 110

Gln Ile Leu Ala Phe Pro Gly Ser Thr Leu Tyr Gln Leu Glu Lys Thr

115 120 125

Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys

130 135 140

Ile Gly Ala Ser Val Leu Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser

145 150 155 160

Leu Ile Lys Arg Gly Pro Ala Tyr Ser Glu Met Ala Leu Phe Ala Gln

165 170 175

Val Asp Ala Asp Gly Lys Leu Arg Leu Val Asn His Leu Gly Ile Asp

180 185 190

Leu Gly His Ser Pro Glu Glu Ile Leu Gly Arg Leu Asp Asp Glu Arg

195 200 205

Trp Gln Pro Asp Asp Val Arg Trp Asp Ala Arg His Ala Ser Asp His

210 215 220

Glu Tyr Ala Glu Arg Val Arg Asp Ile His Ala Asp Thr Pro Ala Arg

225 230 235 240

Phe Asn Ala Asp Gln Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ser Gly Cys Ala Gly

245 250 255

Lys Leu Ala Val Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Thr Glu Pro

260 265 270

Lys Gln Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asp Pro Ala Thr Leu Gly

275 280 285

Glu Leu Arg Arg His Ile Leu Ala Glu Phe Thr His Leu Pro Val Ala

290 295 300

Gly Glu Tyr Met His Arg Asp Ile Phe Asp Ile Ala Glu Val Tyr Gly

305 310 315 320

Lys Asp Thr Phe Val Met Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys Met Pro

325 330 335

Leu Phe Phe Thr Leu Lys Gly Arg Val Asp Ala Trp Leu Ser Lys Leu

340 345 350

Ser Phe Val Lys Pro His Leu Thr Asp Arg Leu Leu Gln Arg Ile Ser

355 360 365

Arg Trp Phe Pro Ala His Leu Pro Lys Arg Leu Lys Gln Tyr Arg Asp

370 375 380

Lys Tyr Glu His His Leu Met Leu Lys Met Ser Gly Asp Gly Val Ala

385 390 395 400

Glu Ala Gln Ala Tyr Leu Gln Glu Tyr Phe Arg Glu Gly Gly Gly Glu

405 410 415

Phe Phe Ala Cys Asp Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Phe Leu His Arg

420 425 430

Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ala Val Arg Tyr His Ala Val His Ala Asp

435 440 445

Glu Val Glu Asp Ile Leu Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg Asn Asp

450 455 460

Gln Glu Trp Phe Glu Arg Leu Pro Pro Glu Phe Asp Asn Asp Leu Ile

465 470 475 480

His Arg Leu Tyr Tyr Gly His Phe Phe Cys His Val Phe His Gln Asp

485 490 495

Tyr Ile Val Lys Lys Gly Val Asp Ala His Ala Leu Lys Glu Lys Met

500 505 510

Leu Ala Ile Leu Ala Ala Arg Gly Ala Glu Tyr Pro Ala Glu His Asn

515 520 525

Val Gly His Leu Tyr Ala Ala Lys Pro Gln Leu Gln Ala Phe Tyr Arg

530 535 540

Gln Leu Asp Pro Thr Asn Thr Phe Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser

545 550 555 560

Lys His Lys Gly Trp Ala Val Lys Ala

565