本發明涉及生物技術和醫學領域，具體涉及一種檢測Pygo2基因突變位點的試劑盒。

背景技術：

Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關重要的作用。如果這條信號通路中的關鍵蛋白發生突變或者異常表達，導致信號異常活化，就可能誘導癌癥的發生。Wnt信號通路包括經典的Wnt信號通路與非經典的Wnt信號通路，在經典通路即Wnt-β-catenin信號通路中，Wnt因子通過激活細胞膜上的Frizzle/LRP5/6協同受體后抑制細胞內游離β-catenin蛋白的磷酸化和降解，細胞質中的β-catenin蛋白水平升高后將發生β-catenin蛋白的核移位，導致細胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能夠聯合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同與TCF/LEF-1轉錄因子家族形成復合體并激活Wnt信號通路下游靶基因的轉錄激活。

Pygo2蛋白是Wnt信號通路中β-catenin下游重要成員之一，目前越來越多的研究已經發現，在很多腫瘤中Pygo2蛋白均呈現高表達。

目前研究核心信號通路的核心分子調控機制，以及某些重要成員在細胞中的表達水平，已經成為治療腫瘤的一種關鍵手段。近年來Wnt信號通路在癌癥中的研究，以及Pygo2蛋白作為Wnt信號通路重要成員其表達水平的研究，已經成為研究開發腫瘤藥物急需解決的重要問題。與此同時，其在多種腫瘤細胞中存在的各種基因突變也越來越多地被發現，尤其是在Pygo2蛋白NHD端及PHD端發生的突變，對Pygo2蛋白發揮功能起著非常重要的作用，例如在膀胱癌細胞中檢測出NHD端R46S突變。

目前普遍應用的基因突變檢測方法為限制小片段長度多態性分析法(RFLP法)和DNA直接測序等。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結合的方法。但是該方法存在以下缺點：RFLP實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導致的假陽性，非閉管操作，易于污染，難以滿足臨床檢測要求。DNA直接測序的原理是：該方法存在以下缺點檢測周期較長，花費昂貴，非閉管操作，難以避免交叉污染，通量不高。DNA直接測序的靈敏度較低，雜合突變、膠壓縮、GC富集區的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數據，需要多次重復測序才可能避免假陽性等，因此直接測序方法難適用于臨床檢測。

而臨床迫切需要開發一種快速、準確、操作簡便和避免交叉污染的檢測Pygo2基因突變的試劑盒，滿足臨床用藥和檢測診斷方面的時效性要求。

Taqman探針是在Real-time PCR技術平臺發展出的熒光檢測技術，探針的5’端含有熒光報告基團，3’端含有熒光淬滅基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，當進行PCR擴增時，Taq DNA聚合酶的5’端到3’端的外切酶活性將探針酶切降解，使得報告基團和淬滅基團分離，發出熒光信號，從而達到熒光信號的積累與PCR產物形成完全同步。

ARMS,(Amplification Refractory Mutation System)，中文全稱叫擴增受阻突變系統也叫等位基因特異性擴增法(Allele Specific Amplification，ASA)，始建于1989年，是基于PCR技術的一種定向檢測點突變的應用方法。ARMS是針對已知突變基因的一種檢測方法之一。檢測的原理是利用了實驗室常用的DNA聚合酶—Taq酶缺乏3’端到5’端外切酶活性的特點，針對突變堿基設計的引物由于錯配而導致擴增反應受阻，當這種阻礙效應達到一定程度時，3’端延伸受阻，反應無法繼續進行，因此如果模板中不含有突變的目標序列，則擴增產物中檢測不到目標條帶。

Taqman-ARMS該技術基于Real-time PCR平臺，結合ARMS突變富集和Taqman特異性熒光檢測兩種技術。利用ARMS引物對突變靶序列進行PCR擴增，Taqman探針對擴增產物進行特異性位點檢測，在Real-time PCR基礎上鑒定特定突變。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供快速、準確、操作簡便和防止污染的檢測Pygo2基因突變位點的試劑盒，解決了現有技術中進行基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污染和靈敏度低等問題，尤其是提供了病理組織之外的非創傷性如血清或血漿等檢測。

為實現上述發明目的，本發明的技術方案為：

一種檢測Pygo2基因突變位點的試劑盒，所述試劑盒包含檢測Pygo2基因R46S突變位點的ARMS引物對和特異識別R46S突變的Taqman探針；所述ARMS引物對由SEQ ID No：1所示的上游引物和SEQ ID No：2所示的下游引物組成；所述Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，其5’端的熒光報告基團為：FAM，3’端的淬滅基團為BHQ。

Pygo2基因R46S突變位點在Pygo2基因的具體位置為密碼子46處，其堿基的變化為AGC>AGG，SEQ ID No：1、2被稱為內引物對。

優選的，所述試劑盒還包括DNA質量控制位點的檢測引物對和識別所得擴增子的Taqman探針，所述引物對由SEQ ID No：4所示的上游引物和SEQ ID No：5所示的下游引物組成，所述Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示，其5’端的熒光報告基團為：HEX，3’端的淬滅基團為BHQ。

SEQ ID No：4、5被稱為外引物對，該外引物對擴增的區域是Pygo2基因中包含R46S突變位點所在區域片段，其序列如SEQ ID No：7所示。

更優選的，所述試劑盒由PCR緩沖液、dNTPs、引物對、Taqman探針、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模板DNA組成，各組分反應時終濃度為：

更優選的，所述試劑盒的反應條件是：42℃逆轉錄20min；94℃預變性，5min；94℃變性，30s；58℃，30s；進行40個循環。

更優選的，利用所述試劑盒完成PCR反應后，如果樣本外引物和內引物擴增曲線呈S型，有Ct值，且ΔCt值<7，可判斷為突變；如果樣本外引物擴增曲線呈S型，內引物擴增曲線平直，可以判為陰性；如果樣本外引物擴增曲線平直，內引物歐增呈S型，可以判斷為假陽性。

更優選的，所述試劑盒還包括兩個陽性對照，該陽性對照為包含外引物擴增區域的質粒和Pygo2基因R46S突變位點所在區域片段質粒。

更優選的，所述試劑盒還包括陰性對照，該陰性對照為滅菌生理鹽水。

本發明與現有技術相比，具有以下優勢：

本發明公開的試劑盒，采用ARMS特異突變富集技術與Taqman探針特異檢測技術相結合，無需測序，即可完成對樣品基因型的判斷；該試劑盒靈敏度高，最高可達到1％，同時特異性好，精度高，檢測成功率為100％，同時可以檢測多個樣本，實現高通量檢測；檢測靈敏度高、檢測范圍寬；無需多次開蓋，避免交叉污染，全部檢測反應可在1小時內完成，且檢測結果容易判斷；該試劑盒可以檢測來自外周血的DNA；根據試劑盒的檢測結果為腫瘤的個性化用藥提供指導。

附圖說明

圖1是本發明Pygo2基因R46S突變ARMS-qPCR試劑盒對野生型人DNA測試的擴增曲線圖；

圖2是本發明Pygo2基因R46S突變ARMS-qPCR試劑盒對含1％Pygo2突變的人DNA測試的擴增曲線圖；

1為外引物擴增曲線，2為內引物擴增曲線。

圖3是本發明Pygo2基因R46S突變ARMS-qPCR試劑盒對陽性樣本DNA測試的擴增曲線圖；

1、3分別是陽性樣本外引物對和內引物對擴增出來的曲線，2為陽性質粒擴增出來的曲線；

具體實施方式

通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。

本發明所使用的PCR緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、MgCl₂均購于上海嶺蘭生物科技有限公司，貨號T1102，其中探針和引物均由上海基康生物技術有限公司合成。

【實施例1】引物探針設計

根據美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)報道的hPygo2mRNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_138300.3)，使用Applied Biosystems公司開發的Primer Express Software for Real-Time PCR軟件設計特異的Pygo2引物與探針，本發明在上游引物的3’端倒數第3個位點上引入了第二個錯配堿基，以增加對突變檢測的特異性。

檢測突變序列熒光探針：5'FAM-AGCGAAGGAAGTCAAATACTC-BHQ3'

檢測突變序列上游引物：5'-GTCCAGAAAGAAGCGATGC-3'

檢測突變序列下游引物：5'-CTCCACCTCCAGTGCTGAG-3'

外引物擴增序列熒光探針5'HEX-AGCGAAGGAAGTCAAATACTC-BHQ3'

外引物上游引物：5'-GCAAGGCCGGTCTGCAAATG-3'

外引物下游引物：5'-CCATTGGATTGGGAGGGAAG-3'

外引物擴增序列：

gcaaggccggtctgcaaatgaagagtccagaaaagaagcgaaggaagtcaaatactcagggccctgcatactcacatctgacggagtttgcaccacccccaactcccatggtggatcacctggttgcatccaacccttttgaagatgacttcggagcccccaaagtgggggttgcagcccctccattccttggcagtcctgtgcccttcggaggcttccgtgtgcaggggggcatggcgggccaggtacccccaggctacagcactggaggtggagggggcccccagccactccgtcgacagccaccccccttccctcccaatcctatgg

本發明實施例中，修飾熒光探針的5’端的熒光報告基團為：FAM、HEX；修飾熒光探針的3’端的淬滅基團為：BHQ,該熒光報告基團與淬滅基團不影響熒光定量PCR的擴增，只需根據探針的熒光報告基團和淬滅基團選擇所用的儀器的型號設置可檢測的熒光信號范圍。其中FAM和HEX的激發波長為470-650nm。接收波長為500-700nm；引物合成后的純化方式為：HAP、PAGE和HPLC純化方式。

【實施例2】Pygo2基因R46S突變檢測試劑盒特異性檢測

構建Pygo2基因R46S突變檢測試劑盒中的陽性質控品，具體為試劑盒中R46S突變的陽性對照品，用于試劑盒檢測時的參照品。

上述陽性對照品通過如下方式獲得：

通過篩選對應R46S突變DNA或者人工合成對應R46S突變DNA，克隆到pGM-T載體中，構建成重組質粒。然后將重組質粒分別轉化大腸桿菌DH5α，經測序確定為重組質粒后，提取重組質粒，經純化后稀釋，制得陽性對照品，備用。

取稀釋后的陽性對照品分別與野生型基因組DNA以不同比例混合，得到野生型樣本(不含有陽性對照品)、1％突變樣本(陽性對照品的模板與野生樣本的模板的比例為1:100，野生型DNA的含量為45ng/反應)，混合后使樣品的OD260/OD280在1.8～2.0之間，制成陽性突變樣本，備用。

結果見圖1-2，由于采用了上述探針和上下游引物，能夠在45ng/反應的野生型DNA背景下實現1％突變Pygo2基因100％檢出，且野生型Pygo2基因零檢出，說明本發明試劑盒具有很好的特異性以及極強的抗干擾能力，大大降低了假陽性。

【實施例3】血液樣本基因DNA抽提

1)向96圓孔板的每孔中加入20μL蛋白酶K，加200μL抗凝全血到96圓孔板中。

2)加200μL Buffer BL，注意不要打濕每孔的邊緣，用96圓孔硅膠片密封各孔，用力混合30s。

3)3000rpm簡短離心使96圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3000rpm后即停止，在培養箱或烘箱中70℃溫浴至少10min。

3000rpm簡短離心使96圓孔硅膠片上的溶液到96圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3000rpm后即停止，取下96圓孔硅膠片，每孔加入200μL乙醇(96-100％)。

用96圓孔硅膠片密封各孔，用力混勻混合15s。3 000rpm簡短離心使96圓孔硅膠片上的溶液到圓孔板內。啟動離心機，當速度達到3 000rpm后即停止。

將96孔DNA板放到一潔凈的96孔1.6ml深孔板。取下圓孔板上的96圓孔硅膠片，將每孔中的溶液轉移至96孔DNA板中，6 000rpm離心4min。

丟棄96孔1.6ml深孔板的濾液，將96孔DNA板放回到96孔1.6ml深孔板上，每孔加入500μL Buffer W1B，用一新的BF-400膜密封96孔DNA板，6000rpm離心4min。

丟棄96孔1.6ml深孔板的濾液，將96孔DNA板放回到96孔1.6ml深孔板上，每孔加入850μL Buffer W2，用另一新的BF-400膜密封96孔DNA板，6000rpm離心4min。

棄濾液，將96孔DNA板放回到96孔1.6ml深孔板上，每孔加入400μL Buffer W2，用另一新的BF-400膜密封96孔DNA板，6000rpm離心4min。

將96孔DNA板放在一潔凈的96孔1.6ml深孔板上，用BF-400膜密封96孔DNA板，6000rpm離心15min。

將96孔DNA板放在另一潔凈的96孔1.6ml深孔板上，每孔加入100-200μL Eluent B或去離子水，室溫靜置2min，用另一新的BF-400膜密封96孔DNA板，6000rpm離心4min洗脫得到DNA。

DNA提取后，取樣2微升，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量，再用紫外分光光度計檢測純度和濃度，以滅菌純化水調整終濃度為30ng/μL。

【實施例4】Pygo2基因R46S突變檢測試劑盒檢測血液樣本

1、試劑配置

取提取的血液樣本DNA、陰性對照、陽性對照5μL，加入PCR反應液，PCR反應液包括：無菌水、具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer，和含Mg離子的溶液。其中，濃度為5U/μL的具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶1μL,濃度為0.4mmol/L的dNTPs 0.8μL,10×PCR Buffer 5μL,濃度為4mmol/L的MgCl₂ 8μL,終濃度為200nM的引物分別1μL,探針0.5μL,滅菌純化水27.7μL。

2、PCR擴增：

將各反應放入熒光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記熒光基因種類、樣品及類型

熒光檢測通道選擇：選擇FAM通道(Reporter：FAM，Quencher：None)；外引物擴增選擇HEX(Reporter：HEX，Quencher：None)。參比熒光(Passive Reference)設置為ROX

擴增程序：42℃逆轉錄20min；94℃預變性，5min；94℃變性，30s；58℃，30s；進行40個循環。

3、數據分析

反應結束后，儀器自動保存結果，利用儀器自帶的軟件進行自動分析，記錄樣本的Ct值和結果。其中Ct值是從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數。儀器軟件根據個樣本Ct值大小，可以判斷檢測結果。如果樣本外引物和內引物擴增曲線呈S型，有Ct值，ΔCt＝Ct(外引物對)-Ct(內引物對)，且ΔCt值<7，可判斷為突變；如果樣本外引物擴增曲線呈S型，內引物擴增曲線平直，可以判為陰性；如果樣本外引物擴增曲線平直，內引物擴增呈S型，可以判斷為假陽性。

抽取腦膠質瘤患者血液樣本37例，提取血液中的DNA作為模板，用該試劑盒按上述實施方案進行檢測，同時抽取正常人血液樣本10例，提取血液中的DNA作為模板。檢測結果顯示，37例膠質瘤患者血液樣本中，試劑盒檢測出36例腦膠質瘤樣本有陽性結果，正常人樣本結果均顯示為陰性。由此可見，檢測Pygo2基因R46S突變，可以輔助診斷腦膠質瘤，一致率為97.30％。陽性樣本的擴增曲線圖見附圖3。