本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種用于檢測K-RAS基因突變的多重熒光PCR檢測試劑盒。
背景技術：
：K-ras基因是在1964年從大鼠肉瘤急性反轉錄病毒中分離出來的，發現它們能夠進行細胞轉化，該基因在真核細胞的生長過程中起著重要的作用。遺傳學、生化及分子生物學等方面的研究表明，K-ras基因在細胞外刺激所產生的信號傳導通路中處于中樞地位，K-ras基因活性物與細胞增殖、凋亡之間關系密切。K-ras基因突變使本應正常死亡的細胞的生存期延長，還能增加抗藥物和紫外光誘導的凋亡。結腸癌、肺癌、胰腺癌常帶有K-ras基因突變，K-ras基因第12、13位密碼子突變約占其突變的95％，其它突變在第61等密碼子上。K-ras基因在燕麥細胞癌中突變率占33％，結腸癌占44％，胰腺癌占90％。K-ras是最容易被激活的原癌基因之一，在所有人類腫瘤中K-ras突變率能達到17％至25％。K-ras基因易激活的主要區域包括密碼子12、13、25、61和63。這些突變激活能導致RAS蛋白聚集，影響GTP結合狀態，從而抑制GTP酶活性和阻抑GTP酶激活蛋白。利用K-ras基因在臨床上可對腫瘤(包括癌前病變)進行診斷，預后評估和治療。通過檢測基因突變來推測腫瘤所處的階段和分化的程度，從而對病情和預后進行評估。隨著現在醫藥行業的發展，已開發出針對腫瘤病變的多種阻斷細胞信號通路的藥物，但是在使用這些藥物時需要確保該信號通路的下游信號分子沒有發生激活突變，而這往往正是現在醫療行業需面對的問題，急需一種快速、簡便、安全、高靈敏、高通量和低成本的K-ras基因突變檢測來輔助這些藥物的臨床運用。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術缺陷，提供一種用于檢測K-RAS基因突變的多重熒光PCR檢測試劑盒。本發明的技術方案如下：一種用于檢測K-RAS基因突變的多重熒光PCR檢測試劑盒，包括：K引物組、E-4引物組、K檢測探針、E-4檢測探針和內標檢測探針；K檢測探針和E-4檢測探針的5’端均修飾有第一熒光報告基團，3’端均修飾有第一熒光猝滅基團；內標檢測探針的序列與E-4檢測探針的序列相同，其5’端修飾有與第一熒光報告基團不同的第二熒光報告基團，3’端均修飾有第二熒光猝滅基團；其中，K引物組由正向引物K-M1-F、K-M2-F、K-M3-F、K-M4-F、K-M5-F、K-M6-F、K-M7-F和反向引物K-M-R組成，依次包括如SEQIDNO01至08所示的序列；E-4引物組由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R組成，依次包括如SEQIDNO09和10所示的序列；該多重熒光PCR檢測試劑盒的每一反應體系的組成如下：K引物組的一正向引物和一反向引物K檢測探針和/或E-4檢測探針E-4引物組內標檢測探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；該多重熒光PCR檢測試劑盒的每一反應體系的反應條件均為：95℃預變性5min，1個循環；95℃變性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15個循環；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環，后30個循環在退火時檢測熒光信號。在本發明的一個優選實施方案中，所述K檢測探針為K-P-C，包括如SEQIDNO11所示的序列。在本發明的一個優選實施方案中，所述E-4檢測探針為E-4-P，所述內標檢測探針為E-4-I，均包括如SEQIDNO12所示的序列。上述各因物及探針具體序列如下表所示：進一步優選的，所述第一熒光報告基團為FAM，所述第一熒光猝滅基團為BHQ，所述第二熒光報告基團為HEX、ROX或VIC，第二熒光猝滅基團為BHQ。本發明的有益效果：1、本發明的試劑盒可用于輔助臨床醫生篩選出可受益于Cetuximab(愛必妥)和Panitumumab(帕尼單抗)等藥物的大腸癌等癌癥患者，適合于患者在進入個體化靶向治療療程之前使用，可為患者個體用藥提供用藥科學依據，降低治療風險以及患者負擔。2、本發明以人類K-RAS基因突變為檢測對象，通過特異引物的優化組合以及熒光探針，從而實現準確、簡單、快速地同時檢測K-RAS基因突變，而且檢測突變的能力高。附圖說明圖1為本發明實施例2的多重熒光PCR反應程序圖。圖2為本發明實施例2中多重熒光PCR檢測K-RAS基因GLY12ASP突變陰性對照樣品檢測曲線圖。圖3為本發明實施例2中多重熒光PCR檢測K-RAS基因GLY12ASP突變的樣品檢測曲線圖。具體實施方式以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。一種用于檢測K-RAS基因突變的多重熒光PCR檢測試劑盒，包括：K引物組、E-4引物組、K檢測探針、E-4檢測探針和內標檢測探針；K檢測探針和E-4檢測探針的5’端均修飾有第一熒光報告基團，3’端均修飾有第一熒光猝滅基團；內標檢測探針的序列與E-4檢測探針的序列相同，其5’端修飾有與第一熒光報告基團不同的第二熒光報告基團，3’端均修飾有第二熒光猝滅基團；優選的，所述第一熒光報告基團為FAM，所述第一熒光猝滅基團為BHQ，所述第二熒光報告基團為HEX、ROX或VIC，第二熒光猝滅基團為BHQ；其中，K引物組由正向引物K-M1-F、K-M2-F、K-M3-F、K-M4-F、K-M5-F、K-M6-F、K-M7-F和反向引物K-M-R組成，依次包括如SEQIDNO01至08所示的序列；E-4引物組由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R組成，依次包括如SEQIDNO09和10所示的序列；該多重熒光PCR檢測試劑盒的每一反應體系的組成如下：K引物組的一正向引物和一反向引物K檢測探針和/或E-4檢測探針E-4引物組內標檢測探針1×PCR緩沖液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；該多重熒光PCR檢測試劑盒的每一反應體系的反應條件均為：95℃預變性5min，1個循環；95℃變性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15個循環；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環，后30個循環在退火時檢測熒光信號。所述K檢測探針為K-P-C，包括如SEQIDNO11所示的序列。所述E-4檢測探針為E-4-P，所述內標檢測探針為E-4-I，均包括如SEQIDNO12所示的序列。上述各因物及探針具體序列如下表所示：實施例1本實施例以人類K-RAS基因外顯子2的GLY12ASP突變為檢測對象，通過特異引物的優化組合以及熒光探針，從而實現準確、簡單、快速地同時檢測GLY12ASP突變，而且檢測突變的能力高達1％。野生型細胞系H460的基因組DNA為野生型模板，以GLY12ASP突變質粒為陽性對照模板，以本試劑盒進行多重PCR檢測，最終以達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為結果判斷的標準(本實施例中的第一熒光報告基團為FAM，第二熒光報告基團為VIC、ROX或HEX，第一和第二熒光猝滅基團均為BHQ)。上述多重熒光PCR檢測的擴增反應體系為：以上試劑組分：1×PCR緩沖液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自中國大連寶生物公司。上述多重熒光PCR檢測的反應條件是95℃預變性5min，1個循環；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個循環；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環，后30個循環在退火時檢測第一熒光報告基團和第二熒光報告基團的熒光信號。上述檢測第一熒光報告基團和第二熒光報告基團的熒光信號的Ct值，是采用Mx3000P熒光PCR擴增儀或Mx3005P熒光PCR擴增儀或ABI7500熒光PCR擴增儀。，一次可檢測96份樣品(包括陰陽性對照)。根據熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果：檢測反應體系的第一熒光報告基團和第二熒光報告基團熒光強度，以第二熒光報告基團的信號達到設定閾值(Ct＞18)時表明上樣DNA量在允許范圍內，第一熒光報告基團的信號結果可信；以第一熒光報告基團的信號達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為0或30：陰性；Ct小于30：陽性。實施例2本實施例中以K-RAS基因熱點突變外顯子2上的GLY12ASP突變為例來分析本發明的多重熒光PCR檢測K-RAS基因21外顯子GLY12ASP突變的方法。實驗用細胞系3株和1個質粒，分別為H460(K-RAS基因野生型)、293T(K-RAS基因野生型)、SW480(K-RAS基因野生型)和GLY12ASP突變質粒；45份健康的無償獻血者全血樣品、45份臨床肺癌樣品(包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血)。利用上述熒光PCR檢測K-RAS基因外顯子2上的GLY12ASP突變的方法包括以下步驟：(1)樣品處理和模板提取質控：樣品適用范圍包括手術切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8μm切片，取5片，或已經制成的5～8μm切片取5片，經過二甲苯脫蠟后，使用Qiagen公司石蠟包埋DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200μl，血漿、血清以及胸腔積液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L，pH8.0)，經紫外分光光度計檢測提取質量，并確定濃度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L，pH8.0)調整DNA濃度到100ng/μl或2ng/μl作為PCR擴增的模板。(2)用本發明的多重熒光PCR試劑盒(本實施例中的第一熒光報告基團為FAM，第二熒光報告基團為VIC、ROX或HEX，第一和第二熒光猝滅基團均為BHQ)對步驟(1)所得的模板進行熒光PCR擴增檢測，配制反應體系：序號物料物料濃度用量(μL)11×PCR緩沖液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54K-M1-F50mM25K-M-R50mM0.16K-P-C-FAM50mM0.17E-4-F50mM0.18E-4-R50mM0.19內標檢測探針50mM0.110Taq酶5U0.511H2O純化水18.912DNA模板2ng/ul513總體積50所述熒光PCR的反應條件如圖1所示：95℃預變性5min，1個循環；95℃變性25s，60℃退火20s，72℃延伸10s，15個循環；95℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30個循環。(3)檢測：采用Mx3000P實時PCR擴增儀(StrataGene公司)后30個循環退火階段檢測第一熒光報告基團和第二熒光報告基團熒光信號，一次可以檢測92份樣品(包括陰陽性對照)。結果判斷：根據熒光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果：檢測反應體系的第一熒光報告基團和第二熒光報告基團熒光強度，以第二熒光報告基團信號達到設定閾值(Ct＞18)時表明上樣DNA量在允許范圍內，第一熒光報告基團信號結果可信；以第一熒光報告基團的信號達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰陽性判斷的標準，Ct值為0或30：陰性；Ct小于30：陽性，檢測結果具體如圖2和圖3所示。前述45份健康獻血者全血樣品以及細胞系H460(K-RAS基因野生型)、293T(K-RAS基因野生型)、SW480(K-RAS基因野生型)，GLY12ASP突變質粒經本發明的體系檢測，只有GLY12ASP突變質粒有熒光信號，其他樣品無熒光信號，進一步證明了熒光PCR的特異性。靈敏度分析：將突變型GLY12ASP突變質粒從10的4次方連續10倍梯度稀釋，分別為10的3次方，10的2次方，10的1次方，10的0次方。每次反應加入5μLDNA。結果表明本發明的熒光PCR方法的靈敏度高，5拷貝DNA基因組即可檢出。選擇性能力分析：固定每次PCR反應總DNA用量，100ng/反應和10ng/反應。先將GLY12ASP突變質粒DNA和野生型細胞系(H460)DNA濃度都調整為20ng/μL和2ng/μL。這樣每個反應加5μL模板即為100ng/反應和10ng/反應。按下述方法配置模擬DNA模板。A：50％即為10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA。B：30％取A液60μL后混入40μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。C：20％取A液40μL后混入60μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。D：15％取B液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。E：10％取C液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。F：5％取E液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。G：1％取F液20μL后混入80μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。H：0.5％取G液50μL后混入50μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。I：0.1％取H液20μL后混入80μL10的3次方GLY12ASP突變細胞DNA，震蕩混均。結果表明本發明的熒光PCR方法的選擇性檢測能力為在10ng總DNA中可以檢出5拷貝的突變DNA，檢測能力為1％。重復性試驗：每個反應分別加入突變GLY12ASP質粒DNA10ng、1ng和100pg，重復10次進行熒光PCR擴增，10次Ct值相差不到0.1個循環。收集手術切除的肺癌標本，全血和血漿標本以及胸水標本共45例，其中30組織樣品，5例血漿，5例胸水，5例全血。其中男性31例，女性14例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。對于外顯子2的GLY12ASP突變，本發明檢測結果與DNA測序結果完全一致：45例樣品中有12例發生外顯子2的GLY12ASP突變，33例均為野生型。本發明可以同時檢測K-RAS外顯子2deGLY12ASP突變，檢測時間僅需90min，因此本發明準、簡單、快捷可滿足突變的快速診斷。而且，多重熒光PCR方法和傳統測序方法結果的符合率為100％，熒光PCR靈敏度和選擇性檢測能力高于傳統測序方法，10ng樣品DNA中含1％的突變DNA即可檢出。本領域普通技術人員可知，用本發明的試劑盒中的K引物組的其他正向引物檢測其他相應基因突變，仍然能夠得到與上述實施例相同或相近的技術效果，仍然屬于本發明的保護范圍。以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。<110>廈門飛朔生物技術有限公司<120>一種用于檢測K-RAS基因突變的多重熒光PCR檢測試劑盒<160>12<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>1aatataaacttgtggtagttggagccga28<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2taaacttgtggtagttggagccgc24<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>3tataaacttgtggtagttggagccgt26<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>4ataaacttgtggtagttggagcca24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5ataaacttgtggtagttggagccc24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6tataaacttgtggtagttggagcct25<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>7taaacttgtggtagttggagctggtta27<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>8accagtaatatgcatattaaaacaagat28<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>9gactctgaagatgtacctatggtccta27<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10cttcttgctaagtcctgagcctgt24<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>11aggcaagagtgccttgacgatac23<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>12tgtgatttgccttctagaacagtaga26當前第1頁1 2 3