本發明涉及臨床應用研究及生物技術領域，具體的說是一種用于獲得人外周血中單個核細胞誘導成EBV-CTL(nasopharyngeal carcinoma EB virus-CTL)的體外培養試劑盒。

背景技術：

據聯合國衛生組織(WHO)的粗略估計，全世界的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)患者，約80％在中國，常見于中國南部，尤以廣東地區發病率較高(20-50/100 000)，鼻咽癌是值得注意和重視的腫瘤。由于鼻咽癌發病部位的特殊性，周圍有許多重要危及器官，無法進行根治性手術，因此放、化療成為鼻咽癌的首選治療方法。隨著放、化療技術的不斷進步，鼻咽癌治療的近期療效顯著提高。但局部復發和遠處轉移仍為鼻咽癌治療失敗的主要原因。因此有必要尋找一些新的治療手段。

以腫瘤的免疫治療為主的腫瘤生物治療是目前臨床治療惡性腫瘤繼手術、放、化療之后的第4種模式，它既可以獨立地治療腫瘤，又可與手術及放、化療結合，具有療效高、特異性強、副作用小等優點，尤其對于中晚期已經發生轉移的惡性腫瘤而言，它具有獨到的治療作用，近年來越來越受到人們的關注。基于腫瘤特異性抗原的免疫治療可以啟動以腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應為主的抗腫瘤效應，有效打擊腫瘤，防止轉移復發且不傷及無關組織。因其抗腫瘤特異性和免疫記憶性是其它方法所不能比擬的，故在腫瘤綜合治療中顯示出很好的應用前景。隨著對免疫應答機制的深入研究，人們已經意識到啟動免疫應答程序的并不是整個抗原分子，而是與MHC分子結合的氨基酸短肽，即CTL表位，因此尋找特異性腫瘤抗原及其相應的CTL表位成為腫瘤免疫治療的關鍵。

細胞毒T淋巴細胞(CTL)是目前研究較多的免疫活性細胞，用表達于腫瘤細胞表面的腫瘤抗原的CTL表位肽刺激機體，可以產生抗原特異性的CTL細胞，從而參與腫瘤免疫應答，其機理在于用CTL表位肽刺激機體后，可引起抗原特異性的CTL細胞的克隆增殖，而CD8+的CTL是目前認為抗腫瘤免疫的主要效應細胞，其向胞外釋放穿孔素、細胞溶解素等物質或通過細胞表面的死亡受體(腫瘤壞死因子受體家族的成員，包括FAS)等溶解(即殺滅)靶細胞，同時亦可分泌IFN-γ等細胞因子間接殺傷腫瘤細胞，為殺傷腫瘤創造一個良好的微環境。體內的初始T淋巴細胞，經過腫瘤抗原刺激后可分化為效應性T細胞即CTL細胞，殺傷腫瘤，其中一部分效應T淋巴細胞可分化為效應型記憶T淋巴細胞，這種記憶性T淋巴細胞對腫瘤相關性抗原再次刺激后可表現出強烈有效的免疫應答，從而發揮殺傷功效，這也是臨床應用CTL抗原肽殺傷腫瘤的一個理論基礎。因此應用基于腫瘤抗原的CTL表位肽直接誘導特異性CTL抗腫瘤應答，已經成為一種方便有效的方法。

鼻咽癌常見的病理類型是未分化非角化性癌，這一類型的鼻咽癌與EB病毒(Epstein—Barr virus EBV)的感染有關，NPC患者90％以上有EBV感染。因而，針對EBV特異性多克隆CTL研究成為目前的研究熱點。Comoli等在Ⅰ期臨床研究(入組10例鼻咽癌患者)中證實CTL治療鼻咽癌的安全性。Straathof等報告用EBV特異性多克隆CTL治療6例復發的鼻咽癌患者，2例完全緩解、2例部分緩解、1例穩定、1例進展，有5例患者治療后外周血EBV拷貝數明顯降低，患者在輸注EBV特異性多克隆CTL后沒有明顯毒副作用。Comoli等用EBV特異性CTL治療10例難治性鼻咽癌患者(Ⅳ期)，治療后所有患者的外周血均檢測出EBV特異性CTL，治療結果：部分緩解(PR)2例、穩定(SD)4例、進展(PD)4例。

綜上所述，用基于腫瘤抗原的CTL表位肽直接誘導EBV特異性CTL的方法，是有效并安全的。急需尋找EBV相應的CTL表位肽，建立高效的EBV-CTL細胞體外培養方法，同時也更有必要設計與之相符的規范的試劑盒來保證培養方法的及時、準確、順利進行。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種用于處理人外周血中單個核細胞EBV-CTL(nasopharyngeal carcinoma EB virus-CTL)體外培養的試劑盒。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種用于EBV-CTL細胞的體外培養試劑盒，包括以下組分：

誘導CTL細胞分化的EBV抗原肽包被瓶；

誘導T細胞分化的包被瓶；

使T細胞攜帶相關抗原刺激EBV-CTL細胞增殖的因子；

和，刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子。

所述體外培養試劑盒包括無血清培養基、分選細胞的細胞分選液和防止細胞聚集的細胞分散劑，防止細胞聚集的細胞分散劑為20％的人血清白蛋白。

所述誘導CTL細胞分化的包被瓶為經EBV抗原肽、CD137單克隆抗體、γ干擾素、白細胞介素15包被的包被瓶；

所述誘導T細胞分化的包被瓶為經抗CD3單克隆抗體、植物凝集素、白細胞介素21包被的包被瓶。

所述誘導CTL細胞分化的包被瓶為將EBV抗原肽、CD137單克隆抗體、γ干擾素、白細胞介素15充分溶解于磷酸鹽緩沖液中得混合包被溶液，將所得包被溶液浸潤整個培養瓶的底面；浸潤后于4℃靜置12-24小時，而后將經EBV抗原肽、CD137單克隆抗體、γ干擾素、白細胞介素15包被的培養瓶于凍干機器內啟動冷凍干燥機的壓縮機，使機器腔室內的溫度降至-40℃，將初始CTL1包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達到＜1000Pa，抽干開始；自動運行5小時后，打開CO₂進氣閥，關閉真空泵；待壓力到110K后關閉CO₂進氣閥，取出包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4℃保存；在規定的保質期內使用。其中，混合包被溶液中EBV抗原肽濃度為120-135ng/mL、CD137單克隆抗體濃度為80-90ng/mL、γ干擾素濃度為0.2-0.25萬單位/mL、白細胞介素15濃度為40-45ng/mL；

所述誘導T細胞分化的包被瓶為將抗CD3單克隆抗體、植物凝集素、白細胞介素21充分溶解于磷酸鹽緩沖液中得混合包被溶液，將所得包被溶液浸潤整個培養瓶的底面。浸潤后于4℃靜置12-24小時，而后將經包被抗CD3單克隆抗體、植物凝集素、白細胞介素21的培養瓶于凍干機啟動冷凍干燥機的壓縮機，使機器腔室內的溫度降至-40℃，將初始CTL2包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達到＜1000Pa，抽干開始；自動運行5小時后，打開CO₂進氣閥，關閉真空泵；待壓力到110K后關閉CO₂進氣閥，取出包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4℃保存；在規定的保質期內使用。其中，混合包被溶液中抗CD3單克隆抗體濃度為200-220ng/mL、植物凝集素濃度為40-45μg/mL、白細胞介素21濃度為100-110ng/mL。

所述刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子為刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子1、細胞因子2和細胞因子4，其中，細胞因子1的成分為50萬單位的IL-2，細胞因子2的成分為50萬單位的IL-2，細胞因子4的成分為200萬單位的IL-2；使T細胞攜帶相關抗原刺激細胞增殖因子為使T細胞攜帶相關抗原刺激EBV-CTL細胞增殖和成熟的細胞因子3，其中，細胞因子3為60ng的EBV抗原肽。

所述細胞因子1的使用濃度為0.35萬單位/mL，細胞因子2的使用濃度為0.14萬單位/mL，細胞因子3的使用濃度為3ng/ml，細胞因子4的使用濃度為0.13萬單位/mL。

一種利用所述用于EBV-CTL細胞的體外培養試劑盒進行體外培養的方法，用于處理樣品的外周血樣品中的單個核細胞，誘導純化獲得EBV-CTL細胞克隆，并在體外進行大量擴增。

具體，將待培養細胞于所述試劑盒內細胞分選液內對T淋巴細胞進行定向分選：而后對CTL細胞及T淋巴細胞進行誘導、分化、培養；培養后經試劑盒內細胞因子而后對CTL細胞及T淋巴細胞進行擴增，擴增后再對特異性EBV-CTL細胞進行擴增，進而實現EBV-CTL細胞的體外培養。

具體操作步驟如下：

第一步、對T淋巴細胞進行定向分選：

將待檢測血樣按1：1的體積比緩慢注入試劑盒細胞分選液上，并離心處理；用移液管吸出分選后的第一層液體即血漿層，移入50mL離心管滅活備用，吸取第二層細胞即環狀乳白色淋巴細胞于新的離心管中；向新收集的細胞中補加生理鹽水，離心處理后棄上清；重復洗兩次；

第二步、同時對CTL細胞及T淋巴細胞進行誘導、分化、培養：

取11mL無血清細胞培養基重懸第一步所得細胞，此為A管。從A管中取出1mL至一支新的50ml離心管中，并補加無血清細胞培養基至10mL，此為B管。

取用于誘導CTL細胞分化的“CTL1”包被瓶一個，所述包被瓶是預先包被了EBV抗原肽、CD137單克隆抗體、γ干擾素、白細胞介素15的細胞培養瓶，用生理鹽水或培養基潤洗一次并棄去，加入第一步分離所得血漿層的血漿1mL；將A管內細胞懸液移入CTL1瓶內；而后將包被瓶放入5％CO₂、37℃的培養箱中培養24h；

取用于誘導T細胞分化的“CTL2”包被瓶一個，所述包被瓶中預先包被了抗CD3單克隆抗體、植物凝集素、白細胞介素21；用生理鹽水或培養基潤洗一次并棄去，加入第一步分離所得血漿層的血漿1mL；將B管內細胞懸液移入CTL2瓶內；而后將包被瓶放入5％CO₂、37℃的培養箱中培養24h；

第三步、同時對CTL細胞及T淋巴細胞進行擴增：

用1mL無血清培養基溶解一支細胞因子1，即50萬單位的白細胞介素-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”中加入300μL；向“CTL1”瓶內添加無血清培養基至100mL，向“CTL2”瓶內添加無血清培養基至50mL，于5％CO₂，37℃培養箱中培養5-6天后，用1mL無血清培養基溶解一支細胞因子2，即50萬單位的白細胞介素-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”中加入300μL；向“CTL1”瓶內添加無血清培養基至250mL，向“CTL2”瓶內添加無血清培養基至250mL；再于5％CO₂，37℃培養箱中繼續培養3-4天，

第四步、對特異性EBV-CTL細胞進行擴增：

用移液管吹下“CTL2”瓶內貼壁細胞，離心后棄去上清，用無血清培養基混勻后加入細胞因子3，即60ng的EBV抗原肽，于室溫孵育1小時；孵育后離心，離心后棄去上清，無血清培養基混勻待用；用移液管吹下“CTL1”瓶內的貼壁細胞，向其中加入細胞因子4，即200萬單位的白細胞介素-2，加入包被瓶中，同時加入10-12mL第一步分離所得血漿層的血漿，將培養瓶中的細胞培養液倒入培養袋中；將“CTL2”瓶中孵育后的細胞倒入培養袋中；用新鮮無血清培養基潤洗“CTL1”包被瓶及載有“CTL2”瓶中孵育后細胞的離心管兩次，將潤洗無血清培養基一并倒入培養袋中，補加培養基至1500ml，將培養袋放入5％CO₂，37℃培養箱中培養；第二天，進行檢菌。

EBV抗原肽是人工抗原多肽片段，即細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位肽，是抗原蛋白中經抗原提呈細胞(APCS)處理后，能與MHC-I類分子結合并共同被T細胞抗原受體(TCR)特異性識別從而誘導相應的CTL克隆產生免疫應答的短肽，在CTL活化過程中起著十分關鍵的作用，決定了CTL的特異性殺傷效應。

CD137(4-1BB)是腫瘤壞死因子受體(Tumonecrosis Factor Receptor，TNFR)超家族的新成員，是存在于細胞表面的II型膜蛋白，由255個氨基酸組成。與其配體CD137L(4-1BBL)結合后介導的共刺激信號，在細胞間相互作用、細胞粘附、抗原遞呈、T細胞共刺激以及信號傳導中起不同的作用，可促進T細胞和NK細胞增殖、細胞因子的分泌等。CD137單抗能協同CD3單抗誘導CD8+T、CD4+T細胞的活化，顯著增強CTL特異性反應。

白細胞介素15(interleukin15,IL-15)是由多種細胞分泌的細胞因子，其本身就是一種潛在的免疫治療方法，具有一定的抗腫瘤作用。該細胞因子能維持IL-2依賴細胞系CTL細胞的增殖,此外還具有調節B細胞、NK細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的功能,誘導淋巴細胞產生IFN-γ及TNF-α的作用,誘導免疫球蛋白的分泌,具有抗腫瘤活性,對DNA疫苗亦有較好的免疫增強作用等。研究還表明,IL-15在抗微生物感染和免疫佐劑等方面表現出巨大的應用前景。

γ-干擾素是由CD4⁺或CD8⁺細胞產生的同源二聚體糖蛋白，可通過多種途徑直接或間接發揮抗腫瘤作用，增強自然殺傷細胞、巨噬細胞以及細胞毒性T細胞的活性。γ-干擾素加入的順序與細胞毒活性密切相關，先加入γ-干擾素后加入白細胞介素-2可提高細胞毒活性。這是因為先加入γ-干擾素可促使外周血單核細胞上白細胞介素-2受體數量增加，從而有效地激活了效應細胞。

抗CD3抗體或抗T細胞受體抗體能模擬生理配體體外激活靜止的T細胞，使之大量增殖，表達白細胞介素-2受體，產生內源性白細胞介素-2。抗CD3單抗具有抗腫瘤轉移的作用，抗體抑制惡性腫瘤的生長可能是免疫增強的效果，抗體使抗腫瘤特異性T細胞數量增多，活性增強，同時內源性細胞因子的誘導放大了這種作用。

植物血凝素(Phytohaemagglutinin,PHA)是一種T細胞的多克隆活化劑，它與T細胞表面識別絲裂原的膜分子結合，可直接使原處于靜止期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，繼而分裂增殖，釋放淋巴因子，并能提高巨噬細胞的吞噬功能。作為干擾素誘導劑可以刺激機體產生白介素-2和干擾素，還可以刺激機體產生非特異性抗體。

白細胞介素21(interlekin21，IL-21)是Ⅰ類細胞因子，由活化的CD4+T細胞、NKT等細胞分泌，屬于γc家族，與IL-2、IL-4、IL-15具有較高的同源性。IL-21是免疫調控網絡中的重要細胞因子，具有廣泛的免疫調節功能，可以增強淋巴細胞的細胞毒性，刺激有機體產生INF-γ，調控B細胞的增殖、分化。眾多的研究發現，IL-21可有效地用于抗腫瘤治療。

白細胞介素-2是T淋巴細胞分泌的一種細胞因子(由133個氨基酸組成的多肽，相對分子質量約為15×10³)。它是人體免疫應答的核心物質，具有免疫增強、抗腫瘤和抗感染等作用。臨床上已用于腎癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、腸癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤、白血病及癌性胸腹水等病癥的治療。與放療、化療比較，白細胞介素-2對正常細胞毒副作用輕微，能減輕腫瘤患者的疼痛，提高患者生活質量。此外結核病、肝炎、艾滋病、性病、成癮性吸毒者及其他免疫功能低下患者均可使用白細胞介素-2。

EBV-CTL細胞是由人工抗原刺激誘導，T細胞攜帶人工抗原進一步誘導催化，培養的一群異質細胞群，單獨用人工抗原刺激誘導對EBV-CTL細胞的增殖及特異性作用小。結合人工抗原的T細胞能有效刺激CTL細胞中的EBV-CTL細胞，使EBV-CTL細胞快速增值，增強其特異性，促進特異性EBV-CTL細胞成熟。使其向胞外釋放穿孔素、細胞溶解素等物質，分泌IFN-γ等細胞因子。

本發明具有的優點及積極效果是：本發明的培養方式，避免了傳統以DC細胞作為抗原提呈細胞培養時間長、費用高昂的弊端。本發明將細胞分為兩部分，一部分以抗原的多肽片段誘導CTL細胞，另一部分作為T細胞進行誘導分化，兩部分同時進行，有效地縮短了培養時間。用人工抗原多肽片段孵育T細胞后，混合培養，進一步刺激CTL細胞，誘導EBV-CTL細胞大量分化增殖、縮短成熟時間，增強EBV-CTL細胞特異性。通過本發明培養方式誘導特異性EBV-CTL細胞分化是極有效、安全、經濟的方式。同時，以多種細胞因子預先包被細胞培養瓶的方法誘導CTL和T細胞分化，不但增加了CTL細胞與多肽片段接觸的面積和時間，使之更容易受到多肽片段刺激而被誘導為EBV-CTL細胞，增加了T細胞與細胞因子接觸的面積和時間，使之更容易受到細胞因子刺激而迅速被誘導分化，而且多種細胞因子協同作用于誘導CTL和T細胞分化可有效提高細胞毒殺傷作用及增強細胞增殖效果，有助于特異性CTL細胞擴增。另外，本發明采用了抽干的方法制備因子包被瓶，可高效保證細胞因子的活性。如果這種方法應用于產業化生產，既可以延長包被瓶的保質期，又降低了對運輸條件的要求，是一種適用于實際生產的優良方法。

另外，本發明試劑盒采用無血清培養基，無血清培養基可達到生物潔凈要求，成分明確，質量穩定，便于質控，克服了人AB血清的缺點，能減少病人意外感染的機會，對于免疫治療的推廣應用有重要意義。與其他方法相比，該試劑盒具有操作簡便、細胞生長快、誘導效率高、殺傷性強、成本低廉、易于規?；a等突出優勢，可以應用于EBV病毒感染的癌癥治療的基礎研究及臨床應用研究。該試劑盒將EBV-CTL細胞體外定向分選、誘導、分化、培養、擴增所需要的復雜試劑和耗材規范的組合在一起并制定了使用說明書，全部操作按照說明書進行，操作規范化、模式化，不僅提高了工作效率，而且降低了人員間操作帶來的細胞質量和產量差異。該試劑盒制備簡單，細胞產率高，活性強，適于工業化生產，開辟了新的過繼性細胞的制備方法，同時也將加速免疫醫學的發展。該試劑盒一旦應用于臨床細胞生物治療，可以有效殺傷腫瘤細胞，提高腫瘤患者生活質量并延長患者生命，對臨床具有極其重要的意義。對于醫院和實驗室，使用該試劑盒，增加細胞培養的成功率、縮短培養時間、節省成本。使用本發明試劑盒處理人外周血樣品中的單個核細胞，可以收獲的CTL細胞總數可達到3×10^-8個以上，具有特異性殺傷作用的CD8⁺陽性CTL細胞數達到1.5×10⁷個以上。

附圖說明

圖1是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養5天的40倍鏡下CTL細胞實拍圖；

圖2是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養5天的40倍鏡下T細胞實拍圖；

圖3是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養7天的40倍鏡下CTL細胞實拍圖；

圖4是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養7天的40倍鏡下T細胞實拍圖；

圖5是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養9天的40倍鏡下CTL細胞實拍圖；

圖6是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養9天的40倍鏡下T細胞實拍圖；

圖7是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養10天的25倍鏡下CTL細胞實拍圖；

圖8是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養10天的40倍鏡下CTL細胞實拍圖；

圖9是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養10天的25倍鏡下T細胞實拍圖；

圖10是人外周血經本發明試劑盒處理后所獲得培養10天的40倍鏡下T細胞實拍圖；

圖11是人的外周血經本發明試劑盒處理后獲得的CTL細胞，經流式細胞儀測定反饋出的可與CTL四聚體A2-1結合的CD8⁺CTL細胞散點圖；其中，CTL四聚體-PE，CD8-PC5，根據CTL四聚體和CD8抗體將CD8⁺細胞分成四部分，右上方是CTL四聚體CD8⁺雙陽細胞；右下方是CD8⁺單陽細胞；左下方是CD8^-陰性細胞；左上方是CTL四聚體單陽細胞；

圖12是人的外周血經本發明試劑盒處理后獲得的CTL細胞，經流式細胞儀測定反饋出的可與CTL四聚體A2-2結合的CD8⁺CTL細胞散點圖；其中，CTL四聚體-PE，CD8-PC5，根據CTL四聚體和CD8抗體將CD8⁺細胞分成四部分，右上方是CTL四聚體CD8⁺雙陽細胞；右下方是CD8⁺單陽細胞；左下方是CD8^-陰性細胞；左上方是CTL四聚體單陽細胞；

圖13人的外周血經本發明試劑盒處理后獲得的CTL細胞，經流式細胞儀測定反饋出的可與CTL四聚體A2-3結合的CD8⁺CTL細胞散點圖；其中，CTL四聚體-PE，CD8-PC5，根據CTL四聚體和CD8抗體將CD8⁺細胞分成四部分，右上方是CTL四聚體CD8⁺雙陽細胞；右下方是CD8⁺單陽細胞；左下方是CD8^-陰性細胞；左上方是CTL四聚體單陽細胞。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明作進一步描述。

本發明試劑盒將人的外周血樣品中的單個核細胞誘導為EBV-CTL細胞的體外培養試劑盒，包括對T淋巴細胞進行定向分選、誘導、分化、培養、擴增，從根本上解決現有CTL細胞的體外培養方法存在的以DC細胞作為抗原提呈細胞培養時間長、成本高、目的細胞與抗原提成細胞培養時間不同步、使用材料、培養時間不一致，有效細胞的培養周期、細胞特異性殺傷效果和數量參差不齊的問題。試劑盒包括用于誘導CTL細胞分化的包被瓶，包被瓶中預先包被了EBV抗原肽、CD137單克隆抗體、γ干擾素、白細胞介素15；用于誘導T細胞分化的包被瓶，包被瓶中預先包被了抗CD3單克隆抗體、植物凝集素、白細胞介素21；用于刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子1、細胞因子2、細胞因子4，用于使T細胞攜帶相關抗原刺激EBV-CTL細胞增殖、成熟的細胞因子3，所述細胞因子1的成分為50萬單位的IL-2，所述細胞因子2的成分為50萬單位的IL-2，所述細胞因子3的成分為60ng的EBV抗原肽，所述細胞因子4的成分為200萬單位的IL-2。

實施例1

本發明所述試劑盒是為CTL細胞體外培養方法準備的規范的、標準化儀器，以下對試劑盒內容物進行詳細介紹：

該試劑盒內容物中包括：用于盛裝液體的無菌離心管，10×15mL/個，17×50mL/個，6×250mL/個；用于吸放液體的無菌移液管，14×10ml/支；用于分選細胞的細胞分選液，10×5mL/支；用于誘導培養CTL細胞分化的EBV抗原肽包被瓶“CTL1”，1×175cm²/個；用于誘導培養T細胞分化的包被瓶“CTL2”，1×175cm²/個；用于為細胞提供生長所需營養的無血清培養基，2×1000mL/瓶；用于作為培養細胞容器的無菌細胞培養袋，1×2000mL/個；用于刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子1，即IL-2，1×50萬IU/支；用于刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子2，即IL-2，1×50萬IU/支；用于和T細胞結合的細胞因子3，即EBV抗原肽，1×60ng/支；用于刺激CTL、T細胞分裂增殖的細胞因子4，即IL-2，2×100萬IU/支；用于檢菌的雙向血培養瓶，4個；用于防止細胞聚集的細胞分散劑，10×1mL/支；用于過濾細胞團的無菌過濾網，6個；用于盛裝細胞懸液的無菌回輸袋，6×200mL/個；用于標注回輸信息的標簽，6個。

本發明所述試劑盒內容物的制備及來源如下：

1.包被瓶的制備

(1)CTL1包被瓶的制備方法為：取10mL磷酸鹽緩沖液溶解EBV抗原肽、CD137單克隆抗體、γ干擾素、白細胞介素15獲得混合包被溶液，充分混勻，所得混合包被溶液中EBV抗原肽濃度為120ng/mL、CD137單克隆抗體濃度為80ng/mL、γ干擾素濃度為0.2萬單位/mL、白細胞介素15濃度為40ng/mL；將獲得混合包被溶液移入175cm²培養瓶中，搖勻，使包被液浸潤整個培養瓶的培養面。4℃靜置至少12小時，制成初始CTL1包被瓶；啟動冷凍干燥機的壓縮機，使機器腔室內的溫度降至-40℃，將初始CTL1包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達到＜1000Pa，抽干開始；自動運行5小時后，打開CO₂進氣閥，關閉真空泵；待壓力到110K后關閉CO₂進氣閥，取出CTL1細胞包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4℃保存；在規定的保質期內使用。

⑵CTL2包被瓶的制備方法為：取10mL磷酸鹽緩沖液溶解抗CD3單克隆抗體、植物凝集素、白細胞介素21獲得混合包被溶液，充分混勻；所得混合包被溶液中抗CD3單克隆抗體濃度為200ng/mL、植物凝集素濃度為40μg/mL、白細胞介素21濃度為100ng/mL，將該溶液移入175cm²培養瓶中，使包被液浸潤整個培養瓶的培養面。4℃靜置至少12小時，制成初始CTL2包被瓶；啟動冷凍干燥機的壓縮機，使機器腔室內的溫度降至-40℃，將初始CTL2包被瓶瓶口擰松，放入干燥室；開啟真空泵，使壓力達到＜1000Pa，抽干開始；自動運行5小時后，打開CO₂進氣閥，關閉真空泵；待壓力到110K后關閉CO₂進氣閥，取出CTL2細胞包被瓶，擰緊蓋子，封好口，4℃保存；在規定的保質期內使用。

2.細胞分選液的制備

將CTL細胞分選液用無菌移液器分裝到15mL離心管中，5mL/支。貼標簽，4℃保存。

3.磷酸鹽緩沖液購買于北京中杉金橋生物技術有限公司(2000mL/袋)；白細胞介素-2購買于北京雙鷺藥業股份有限公司(50萬單位/支，100萬單位/支)；EBV抗原肽，德國JPT公司(25μg/支)；抗CD3單克隆抗體購買于日本轉基因公司(5mg/支)；γ-干擾素購買于山東泉港藥業有限公司(100萬單位/支)；CD137單克隆抗體購買于美國BIOLEGEND公司(100μg/支)；白細胞介素-15購買于美國Amoytop Biotech公司(100μg/支)；白細胞介素-21購買于美國Amoytop Biotech公司(100μg/支)；植物血球凝集素(PHA)購買于上海伊華公司(10mg/支)；T淋巴細胞分離液購買于SIGMA(500ml/瓶)；人血清白蛋白，購買于美國CSL Behring AG(10g/50mL/瓶)；無血清培養基購買于珠海貝索生物公司(1000mL/瓶)。離心管和移液管購買于美國康寧公司，培養袋購于NIPRO(SHANGHAI)Co.,Ltd。

本發明所述EBV-CTL細胞的體外培養試劑盒主要用于EBV-CTL細胞體外定向分選、誘導、分化、培養、擴增；主要應用于相應HLA分型的EBV感染的患者的臨床細胞生物治療，也可以應用于相關的基礎醫學研究、臨床應用研究及生物技術研究。利用本發明試劑盒中內容物完成的具體培養方法如下：

實施例2

結合圖1-10對本發明作詳細描述。以人外周血為處理樣品，使用本發明所述試劑盒中內容物分選誘導EBV-CTL細胞。具體操作步驟如下：一.血液處理

1.將50mL抗凝血注入1支50mL離心管中。

2.將血樣緩慢注入細胞分選液上，每管6mL。

3.550xg，30min，4℃離心。

4.離心后的離心管中細胞由上至下分為四層。(第一層：血漿；第二層：環狀乳白色淋巴細胞層；第三層：透明細胞分選液層；第四層：紅細胞層。)收集第一層移入一支新的50mL離心管中，56℃滅活30min，即為自體血漿；收集第二層平均移入兩支50mL新的離心管中，分別加入無血清細胞培養基ALyS505N至50mL，混勻。

5.將兩管細胞離心，780xg，15min，4℃。

6.棄去上清，用無血清細胞培養基ALyS505N將兩管細胞重懸后合為一管，補加無血清細胞培養基ALyS505N至50mL，離心，400xg，15min，4℃。

7.血漿滅活完成后，離心，2100xg，10min，4℃。

8.離心后的細胞棄去上清，移入11mL無血清細胞培養基ALyS505N充分混勻，此為A管。從A管中取出1mL至一支新的50ml離心管中，并補加無血清細胞培養基ALyS505N至10mL，此為B管。向兩支離心管內各加入1mL上述血液處理過程中分離的第一層血漿。

9.將A管內細胞懸液移入CTL1瓶內，將B管內細胞懸液移入CTL2瓶內。

二.補液，加細胞因子1和2

1.血液處理第二天，取出培養物。向“CTL1”瓶內添加無血清細胞培養基ALyS505N至100mL，向“CTL2”瓶內添加細胞培養基至50mL。用1mL細胞培養基溶解一支50萬IL-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”中加入300μL。

2.血液處理第七天左右，分別向兩瓶內添加細胞培養基至250mL。用1mL無血清細胞培養基ALyS505N溶解一支50萬IL-2，向“CTL1”中加入700μL，向“CTL2”加入300μL。

三.轉袋

1.血液處理第十天左右，鏡下觀察兩瓶細胞均鋪滿瓶底并有部分細胞懸浮時，可進行轉袋操作。(見圖9-10)

2.用移液管吹下“CTL2”瓶內貼壁細胞，倒入5支50mL離心管中，離心，400xg，15min。

3.離心后棄去上清，用20mL細胞培養基混為一管，加入60ngEBV抗原肽，于室溫孵育1小時。

4.孵育后，離心，400xg，10min；離心后棄去上清，加20mL無血清細胞培養基ALyS505N混勻，離心，400xg，15min。

5.離心后棄去上清，用50mL無血清細胞培養基ALyS505N混勻待用。

6.用移液管吹下“CTL1”瓶內的貼壁細胞，向其中加入200萬IL-2，10-12mL上述血液處理過程中分離的第一層血漿。

7.取出細胞培養袋，標注好姓名、日期。取下細胞培養袋管帽、50ml注射器針頭和內栓。將培養袋進液口與注射器頭相連。移入“CTL1”瓶內細胞液，用適量新鮮無血清細胞培養基ALyS505N潤洗培養瓶兩次，潤洗液也移入培養袋。

8.向培養袋內移入步驟5中的細胞液，并向培養袋內移入剩余的全部無血清細胞培養基ALyS505N。

9.夾緊進液口，除去注射器，蓋好管帽。

四.檢菌

1.轉袋后第一天，取出培養物。將袋內細胞液混勻后倒出10mL于一支50mL離心管中，用20mL注射器吸取5mL細胞液注入兩個雙相血培養瓶中，一瓶送與第三方進行無菌檢測，一瓶用于自檢。檢菌溫度37℃。

2.雙相血培養瓶上要注明姓名和日期。

五.細胞收集

1.血液處理第十七天左右，觀察細胞生長情況，確定回輸時間。

2.將袋內細胞液倒滿1支250mL離心管中，離心，400×g，5min，4℃。剩余細胞繼續培養。

3.離心后棄去上清，加100mL生理鹽水混勻，離心，400×g，5min，4℃。重復此步驟2次。

4.取兩支50mL離心管，用5mL注射器分別向其中注入20％的人血清白蛋白2mL。

5.將無菌篩網放到離心管上。

6.用移液管吸取混勻后的細胞懸液，用無菌篩網過濾。

7.取一個細胞收集袋，剪開管口，連接50mL注射器，倒入50mL離心管內的細胞，加生理鹽水至150-200mL。

8.用止血鉗夾住管口，熱合機封口。粘貼已填寫好的自體CTL標簽。

在操作過程中應該注意以下幾點：

1.將血液注入細胞分選液上時，應輕柔緩慢，切勿打破界面。

2.培養瓶放入培養箱內培養時，瓶蓋要擰松；將培養瓶拿出培養箱時，瓶蓋藥擰緊。

3.每天觀察細胞生長狀況，發現培養袋中的細胞出現細胞集落時，輕揉培養袋打散集落。

4.操作過程要求在萬級潔凈實驗室內的百級超凈工作臺內完成，以保證整個過程無菌。

5.培養瓶與培養袋應盡可能的水平放置。避免培養袋與培養箱內的不銹鋼架發生摩擦，造成破損。

圖1-10是該培養試劑盒培養過程中不同時期細胞培養的狀態圖片；取回輸前的細胞懸液進行細胞計數，結果表明，50mL的外周血經本方法處理后，可收獲細胞數約1×10^-9個。經本發明方法處理收獲的細胞進行流式細胞儀檢測，結果如圖11-13所示。細胞群中CD8⁺的細胞約占全部回輸細胞的56.1％(見圖11-13)，其中特異性EBV-CTL約占全部回輸細胞的39.0％(見圖11-13)，由此可以看出，本發明方法培養CTL細胞，殺傷性CTL細胞和特異性EBV-CTL細胞回輸總數均可達到3×10^-8個以上，具有較高的有效細胞收率。