本公開涉及生物技術領域，具體地，涉及一種TIL細胞體外擴增培養基組合和培養方法。

背景技術：

腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)是浸潤于腫瘤組織中以腫瘤抗原特異性CD4⁺、CD8⁺T細胞為主，同時包括B細胞和NK細胞的細胞群。因TIL與腫瘤細胞密切接觸，理論上可以對腫瘤細胞產生特異性的殺傷作用。TIL療法是一種腫瘤特異性的細胞免疫療法，將體外培養增殖后的TIL回輸到體內，其在血液及腫瘤中可以長時間存活并行使殺傷功能。該方法具有高效、特異、副作用小等優點，可應用于實體瘤和各類晚期癌性胸、腹水患者的治療。目前臨床應用的TIL的來源主要有兩個方面：1、手術切除的腫瘤組織或淋巴結；2、癌性胸腹水。常規的TIL細胞培養方法受腫瘤大小、腫瘤浸潤程度以及胸腹水量等諸多因素的限制，細胞在培養過程中的增殖速度慢、增殖倍率低，培養獲得的細胞往往殺傷活性較差從而不能滿足臨床治療的要求。此外，由于TIL不僅包含腫瘤殺傷性CD8⁺T細胞(CTL)，而且還包含抑制CTL抗腫瘤功能的調節型CD4⁺CD25⁺T細胞(Treg細胞)和髓系衍生抑制細胞(MDSC)。現有的TIL細胞擴增方法中往往通過使用大量IL-2的方式刺激腫瘤組織或胸腹水中淋巴細胞增殖，然而IL-2用量過高可使培養的TIL中CD4⁺CD25⁺Treg細胞數量增加，令其難于有效發揮腫瘤殺傷效應，導致腫瘤免疫逃逸發生。因此有必要開發一種適用于大量擴增有殺傷活性TIL細胞的技術從而為其臨床應用提供技術支持。

技術實現要素：

本公開的目的是提供一種適用于大量擴增有殺傷活性TIL細胞的技術。

為了實現上述目的，本公開提供一種TIL細胞體外擴增培養基組合，包括誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基；

所述誘導培養基的組成成分包括：基礎培養基、滅活動物血清、香菇多糖、黃芪多糖、黨參多糖和枸杞多糖；

所述增殖培養基的組成成分包括：基礎培養基、滅活動物血清、白細胞介素和單克隆抗體；

所述活化適應培養基包括：基礎培養基、胰島素、轉鐵蛋白和谷氨酰胺。

可選地，所述白細胞介素為IL-7、IL-12和IL-15中的至少一種。

可選地，所述白細胞介素為IL-7、IL-12和IL-15。

可選地，所述單克隆抗體為CD3單克隆抗體、CD134單克隆抗體和PD-1單克隆抗體中的至少一種。

可選地，所述基礎培養基為AIM-V培養基和RPMI-1640培養基中的至少一種，所述滅活動物血清為胎牛血清。

可選地，所述誘導培養基包括以下含量的各組分：

香菇多糖20-50μg/mL、黃芪多糖20-50μg/mL、黨參多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、體積百分含量為5-10％的胎牛血清；AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：1-1.4。

可選地，所述增殖培養基包括以下含量的各組分：

IL-7 5-15ng/mL、IL-12 5-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、CD3單克隆抗體10-30ng/mL、CD134單克隆抗體10-30ng/mL、PD-1單克隆抗體10-30ng/mL、體積百分含量為5-10％的胎牛血清；AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：1.2-1.6。

可選地，所述活化適應培養基包括以下含量的各組分：

胰島素1.5-3μg/mL、轉鐵蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM；AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：2-4。

本公開的第二個方面還提供了一種TIL細胞體外擴增培養方法，包括使用本公開第一個方面所述的TIL細胞體外擴增培養基組合，所述方法包括：

誘導培養：將TIL細胞接種于誘導培養基中培養2-4天獲得誘導培養細胞；

增殖培養：將所述誘導培養細胞接種于增殖培養基中培養7-12天獲得增殖培養細胞；

活化適應：將所述增殖培養細胞接種于活化適應培養基中培養0.5-1.5天。

可選的，所述方法還包括從胸腹水中提取TIL細胞：

收集胸腹水，添加終濃度為12-15U/mL的肝素鈉，用Ficoll分離液進行密度梯度離心收集單個核細胞；將所述單個核細胞用基礎培養基重懸獲得細胞懸液，用免疫磁珠對細胞懸液進行分選收集TIL細胞，再利用所述TIL細胞體外擴增培養基組合進行培養。

可選的，所述誘導培養、增殖培養和活化適應在免疫細胞體外擴增裝置中進行，所述裝置包括細胞培養袋(1)和承載所述細胞培養袋(1)的承載臺(3)，該裝置還包括容納于所述細胞培養袋(1)中的磁性浮球(2)以及在懸掛于所述細胞培養袋(1)上方并且能夠驅動所述磁性浮球(2)在所述細胞培養袋(1)中移動的磁性懸掛驅動器(4)，所述磁性懸掛驅動器(4)包括能夠吸引所述磁性浮球(2)的磁體片(41)和能夠懸掛且驅動所述磁體片(41)在所述細胞培養袋(1)上方移動的懸掛驅動架(42)；所述細胞培養袋(1)中充有細胞培養液，述細胞培養液中含有培養基以及待擴增的細胞；所述磁性浮球(2)在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上；所述磁體片(41)能夠在所述細胞培養袋(1)上方往復移動，從而通過磁力的作用，驅動所述磁性浮球(2)在漂浮狀態下在培養液液面往復移動，所述磁性浮球(2)在培養液液面以下的部分能夠攪拌培養液。

本公開的發明人對于TIL細胞的體外擴增技術進行的大量的研究，意外的發現與細胞體外擴增培養體系中加入的IL-2相比較，加入IL-7和IL-15可得到與相同擴增倍數和體外功能的TIL。IL-7和IL-15既能夠刺激T淋巴細胞的體外增殖，又能夠維持中樞記憶CD8⁺T細胞的干性，促進CD8⁺T細胞產生IFN-γ，對腫瘤細胞起到直接殺傷作用，并減少CD4⁺CD25⁺Treg細胞的數量，發揮了協同增效的作用。故IL-7和IL-15聯合使用可代替高劑量IL-2應用于TIL的體外擴增。同時，CD3單克隆抗體作為誘導劑活化和擴增CD8⁺T細胞；CD134單克隆抗體可刺激TIL中CD8⁺T細胞亞群的共刺激信號，促進細胞的活化，提高細胞穿孔素和顆粒酶的表達，增強其殺傷能力；PD-1單克隆抗體可促進CD8⁺T細胞擴增，加強細胞因子和顆粒酶分泌，提高對腫瘤細胞殺傷能力，并解除Treg細胞的免疫抑制作用。誘導培養過程中利用多糖類中藥提取物減弱了MDSC的免疫抑制作用。

通過上述技術方案，本公開所提供的TIL細胞體外擴增培養基不需要使用大量IL-2進行淋巴細胞刺激，進而避免了TIL細胞中含有大量Treg細胞和NK細胞的缺陷，增加了細胞在臨床應用中的有效性。而且采用含有不同組分的按照一定的配比方式制備的培養基在細胞生產的特定階段進行有針對性的培養，可以更好的滿足TIL細胞在不同階段的生長需求，培養基中的各組分發揮協同增效作用可以更有效的擴增和活化TIL細胞，培養獲得的TIL細胞數量更多，細胞在臨床治療中也具有更高的活性。

本公開的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

附圖是用來提供對本公開的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構成對本公開的限制。在附圖中：

圖1是本公開的免疫細胞體外擴增裝置中一種可選的實施方式的切向示意圖。

圖2是本公開的免疫細胞體外擴增裝置中一種可選的實施方式的俯視示意圖。

圖3是本公開的免疫細胞體外擴增裝置中一種可選的實施方式的部件示意圖。

圖4是實施例和對比例TIL細胞擴增倍數結果示意圖。

圖5是實施例和對比例培養的TIL細胞中各類細胞數量百分比示意圖；

A是CD3⁺和CD3⁺CD8⁺細胞數量百分比示意圖；

B是Treg細胞數量百分比示意圖。

圖6是實施例和對比例培養的TIL細胞殺傷率結果示意圖。

附圖標記說明

1 細胞培養袋 2 磁性浮球 3 承載臺

4 磁性懸掛驅動器

11 進氣口 12 出氣口 13 進液口

14 出液口 15 人工瓣膜片

31 恒溫托盤 32 底座

41 磁體片 42 懸掛驅動架 43 懸臂

431 限位孔 432 驅動孔 4310 限位桿

4311 支撐架 4320 絲桿 4321 電動機

具體實施方式

以下結合附圖對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。

本公開的第一個方面提供了一種TIL細胞體外擴增培養基組合，包括誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基；

所述誘導培養基的組成成分包括：基礎培養基、滅活動物血清、香菇多糖、黃芪多糖、黨參多糖和枸杞多糖；

所述增殖培養基的組成成分包括：基礎培養基、滅活動物血清、白細胞介素和單克隆抗體；

所述活化適應培養基包括：基礎培養基、胰島素、轉鐵蛋白和谷氨酰胺。

在本公開的具體實施過程中，根據細胞培養的不同階段依次先后使用所述誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基。

優選的，所述基礎培養基為AIM-V培養基和RPMI-1640培養基中的至少一種，所述滅活動物血清為胎牛血清。

特別優選的，為了進一步提高TIL細胞的增殖數量和活性，所述基礎培養基由AIM-V培養基與RPMI-1640培養基組成。

可選的，所述誘導培養基中還可以含有其他來自天然中藥物質的提取物，所述天然中藥提取物可以為已經證實對TIL細胞的增殖有積極影響的中藥提取物種類，例如，所述中藥提取物包括但不限于人參多糖、人參皂苷、黃岑素、三七皂苷、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯、姜黃素、云芝多糖、沙苑子總黃酮、蟲草多糖、三葉青提取物等。本公開對于添加的天然中藥提取物的量沒有特別的限制，只要能夠有效的提高細胞的增殖數量和活性即可。

可選的，所述誘導培養基中還可以含有細胞培養中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、氨基酸、無機鹽、抗生素等。

在本公開的一種優選的實施方式中，所述誘導培養基包括以下含量的各組分：香菇多糖20-50μg/mL、黃芪多糖20-50μg/mL、黨參多糖20-50μg/mL、枸杞多糖20-50μg/mL、體積百分含量為5-10％的胎牛血清；AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：1-1.4。

更為優選的，為了提高誘導培養效果，所述誘導培養基包括以下含量的各組分：香菇多糖30-40μg/mL、黃芪多糖30-40μg/mL、黨參多糖30-40μg/mL、枸杞多糖30-40μg/mL、體積百分含為8-10％的胎牛血清；AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：1.1-1.3。

所述誘導培養基的作用在于通過合理配比利用具有誘導激活作用的物質，對TIL細胞進行激活，促使其分泌細胞因子等物質進而加快細胞的增殖。TIL細胞可以在所述誘導培養基中誘導培養2-4天獲得誘導培養細胞。

可選的，所述增殖培養基中還可以含有細胞培養中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、氨基酸、無機鹽、抗生素等。

可選的，所述增殖培養基還可以含有其它具有TIL細胞刺激作用的細胞因子組分，例如腫瘤壞死因子、表皮生長因子等；所述白細胞介素為IL-7、IL-12和IL-15中的至少一種。在本公開的一種特別優選的實施方式中，所述白細胞介素為IL-7、IL-12和IL-15。

優選的，所述增殖培養基包括以下含量的各組分：IL-7 5-15ng/mL、IL-125-15ng/mL、IL-15 5-15ng/mL、CD3單克隆抗體10-30ng/mL、CD134單克隆抗體10-30ng/mL、PD-1單克隆抗體10-30ng/mL、體積百分含量為5-10％的胎牛血清；AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：1.2-1.6。

所述增殖培養基的作用在于通過合理配比和利用能夠促進TIL細胞增殖的物質實現細胞的大量體外增殖。誘導培養后的細胞可以在所述增殖培養基中增殖培養7-12天獲得增殖培養細胞。

所述活化適應培養基還可以含有細胞培養中所常用的添加物，例如，葡萄糖、維生素、氨基酸、無機鹽、抗生素等。

優選的，所述活化適應培養基包括以下含量的各組分：胰島素1.5-3μg/mL、轉鐵蛋白2-3μg/mL、谷氨酰胺1-2mM；AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：2-4。

所述活化適應培養基的作用在于為增殖培養后的TIL細胞提供接近體內條件的營養環境，使得TIL細胞在臨床應用時能夠更為有效的發揮生物學作用，增殖培養后的細胞可以在所述活化適應培養基中培養0.5-1.5天。

本公開的第二個方面提供一種TIL細胞體外擴增培養方法，包括使用本公開第一個方面所述的TIL細胞體外擴增培養基組合，所述方法包括：

誘導培養：將所述基礎培養細胞接種于誘導培養基中培養2-4天獲得誘導培養細胞；

增殖培養：將所述誘導培養細胞接種于增殖培養基中培養7-12天獲得增殖培養細胞；

活化適應：將所述增殖培養細胞接種于活化適應培養基中培養0.5-1.5天。

在本公開的第二個方面中，每次進行細胞接種的細胞密度為4.5×10⁵個/mL-5.5×10⁵個/mL。

細胞培養的條件包括在5％CO₂，37℃的環境下進行。

其中，在所述增殖培養階段，優選每兩天進行一次細胞傳代并更換一次新鮮的增殖培養基，傳代可以利用本領域常規的TIL細胞傳代方法進行。

在本公開的一種可選的實施方式中，所述方法還包括從胸腹水中提取TIL細胞：

收集胸腹水，添加終濃度為12-15U/mL的肝素鈉，用Ficoll分離液進行密度梯度離心收集單個核細胞；將所述單個核細胞用基礎培養基重懸獲得細胞懸液，用免疫磁珠對細胞懸液進行分選收集TIL細胞，再利用所述TIL細胞體外擴增培養基組合進行培養；其中，用于重懸所述單個核細胞的基礎培養基中AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：0.5-1。

本公開對于磁珠分選的方法沒有特別的限制，可以通過本領域常規的TIL細胞磁珠分選方式進行。

在本公開的一種優選的實施方式中，所述誘導培養階段、增殖培養階段和活化適應階段在免疫細胞體外擴增裝置中進行，該裝置包括細胞培養袋1和承載所述細胞培養袋1的承載臺3，其中，該裝置還包括容納于所述細胞培養袋1中的磁性浮球2以及在懸掛于所述細胞培養袋1上方并且能夠驅動所述磁性浮球2在所述細胞培養袋1中移動的磁性懸掛驅動器4，所述磁性懸掛驅動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅動所述磁體片41在所述細胞培養袋1上方移動的懸掛驅動架42；所述細胞培養袋1中充有細胞培養液，述細胞培養液中含有培養基以及待擴增的細胞；所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上；所述磁體片41能夠在所述細胞培養袋1上方往復移動，從而通過磁力的作用，驅動所述磁性浮球2在漂浮狀態下在培養液液面往復移動，所述磁性浮球2在培養液液面以下的部分能夠攪拌培養液。

其中，在使用狀態下，所述細胞培養袋1中充有細胞培養液，所述細胞培養液中含有培養基以及待擴增的細胞，其中，所述培養基為本公開所述的誘導培養基、增殖培養基或活化適應培養基。所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上。所述磁體片41能夠在所述細胞培養袋1上方往復移動，從而通過磁力的作用，驅動所述磁性浮球2在漂浮狀態下在培養液液面往復移動，所述磁性浮球2在培養液液面以下的部分能夠發揮柔和地攪拌培養液的作用，從而在所述細胞培養袋1中模擬體內環境，由此促進待擴增的細胞的生長和增殖。所述磁體片41可以為永磁體或電磁體。所述磁體片41的形狀可以設置為弧形，以維持所述磁性浮球2的穩定。

可選地，所述懸掛驅動架42包括固定連接在所述磁體片41上的懸臂43；所述懸臂43上開設有至少一個限位孔431和至少一個設置有內螺紋的驅動孔432；所述懸掛驅動架42還包括至少二個支撐架4311以及限位連接在所述支撐架4311上的限位桿4310和絲桿4320；所述限位桿4310可滑動地穿過所述限位孔431；所述絲桿4320上設置有與所述驅動孔432的內螺紋匹配的外螺紋并螺旋穿過所述驅動孔432，且所述絲桿4320能夠通過繞軸線轉動驅動所述懸臂43沿所述限位桿4310滑動。

其中，所述懸掛驅動架42可以不限于上述結構，只要能驅動所述磁體片41移動即可。所述懸臂43和所述支撐架4311的高度可以設置為能夠按需要調節的結構。所述磁體片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以進行合理地調節，只要能維持所述磁性浮球2在浮力和磁力的合力作用下漂浮在培養液液面上且所述磁性浮球2在磁力作用下能夠移動即可。所述磁體片41的磁性大小以及所述磁性浮球2的磁性大小可以通過所使用的磁性材料的性能和數量的合理改變而得到合理調節。所述磁體片41的數量可以為一個或多個，所述磁性浮球2的數量也可以為一個或多個。

可選地，該裝置還包括能夠驅動所述絲桿4320進行軸向轉動的電動機4321。所述電動機4321的轉速可以通過控制器進行合理地控制，避免磁性浮球2的移動速度過快或過慢。

可選地，在該裝置的使用狀態下，所述磁性浮球2能夠不與所述細胞培養袋1的壁接觸。也就是說，所述磁體片41與所述磁性浮球2之間的磁力應當小于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2脫離培養液液面。同時，所述磁體片41與所述磁性浮球2之間的磁力與所述磁性浮球2的合力應當大于所述磁性浮球2的重力以避免所述磁性浮球2沉底。

可選地，在該裝置的使用狀態下，以所述磁性浮球2的體積計，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述細胞培養袋1中的細胞培養液液面以上且剩余部分位于液面以下。這樣可以使得所述磁性浮球2便于移動，且具有較好的驅動液流的攪拌效果。

可選地，所述磁性浮球2的外殼為具有生物相容性的外殼，且所述磁性浮球2中設置有用于提供浮力的空腔。其中，生物相容性的外殼可以使用細胞培養領域的常規生物相容性材料制成，例如使用聚乳酸塑料、納米羥基磷灰石材料和聚醚醚酮材料制成。用于提供浮力的空腔可以為一個或多個，空腔中可以填充輕質材料，例如泡沫塑料。所述磁性浮球2中所使用的磁性材料可以為永磁體和/或軟磁體。

可選地，所述細胞培養袋1上開設有可封閉的進氣口11、出氣口12、進液口13和出液口14中的至少一者。其中，所述進氣口11可以用于通入新鮮的培養用氣體(例如體積百分比分別為95％的空氣與5％的二氧化碳的混合氣體)。所述出氣口12可以實現培養用氣體的循環。通入新鮮的培養用氣體可以帶有高于大氣壓的壓力，所述出氣口12可以連接有限壓閥。進液口13可以用于向所述細胞培養袋1充入含有培養基以及待擴增的細胞的培養液。所述出液口14可以用于排出舊的培養基或者排出培養擴增后的培養液。

可選地，所述出氣口12和/或所述出液口14上設置有能夠阻止細胞通過的篩網。例如所述出液口14上可以設置有濾布，在開啟所述出液口14時，可以將廢舊培養基過濾排出而將細胞過濾留存在所述細胞培養袋1以內。也可以從所述出液口14反向通入新鮮培養基而將濾布上的細胞反向沖洗至細胞培養袋1以內，繼續進行培養擴增。

可選地，所述細胞培養袋1的內部還設置有模擬血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述人工瓣膜片15可以適當地模擬生理狀態下的血管瓣膜，也可以適當地增加攪拌液流效果。

可選地，所述承載臺3包括能夠維持細胞培養恒溫的恒溫托盤31和支撐所述恒溫托盤31的底座32。所述恒溫托盤31可以在15-40℃的溫度內選擇一個溫度區間保持恒溫，從而使得細胞培養擴增能夠脫離復雜的培養設備而獨立運行。

本公開提供的用于細胞體外擴增的裝置所提供的擴增條件優于不進行攪拌的培養擴增條件，也優于其他非懸浮式底部磁性攪拌的培養擴增條件，能夠取得更好的擴增效果。

所述免疫細胞體外擴增裝置能夠在體外模擬TIL細胞的體內增殖環境，實現模擬體內狀態的蠕動式非接觸攪拌，使得免疫細胞在培養過程中降低團聚并充分吸收本公開所述的培養基中的養分并接受信號分子的刺激，提高擴增的細胞收率以及細胞活性。

以下結合實施例具體說明本公開的技術方案。

實施例1

按照表1中給出的培養基成分配制誘導培養基、增殖培養基和活化適應培養基備用。

無菌條件下，收集臨床診斷為肺癌患者的胸腹水1000mL，加入12U/mL的肝素鈉；將添加有肝素鈉的胸腹水離心收集細胞沉淀，用Ficoll分離液進行密度梯度離心收集分層液界面上的單個核細胞，用AIM-V無血清培養基洗滌2次后用基礎培養基重懸(AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：0.8)獲得細胞懸液，用免疫磁珠對細胞懸液進行分選，收集TIL細胞。

將TIL細胞調整細胞密度至5×10⁵個/mL，在5％CO₂、37℃的環境下于誘導培養基中進行誘導培養3天獲得誘導培養細胞。將細胞離心收集起來，調整細胞密度至5×10⁵個/mL，在5％CO₂、37℃的環境下進行增殖培養10天(每兩天傳代換液一次)獲得增殖培養細胞。將細胞離心收集起來，調整細胞密度至5×10⁵個/mL，在5％CO₂，37℃的環境下，進行活化適應培養1天后收集擴增后細胞并計數B，計算細胞的擴增倍數用B除以A獲得的數值即為細胞的擴增倍數。將所述擴增后細胞用PBS洗滌兩次，然后調整細胞密度后用流式細胞儀檢測TIL細胞群中各類細胞的數量百分比。結果如表5和圖4-5所示。

以對數生長期的A549細胞作為靶細胞，按效靶比為20：1的比例，取培養的效應細胞即TIL 1×10⁵約100μL與A549細胞5×10³約100μL混合加入96孔板中，同時設效應細胞孔、靶細胞孔，每組均設3個平行孔，每孔終體積為200μl，37℃、5％CO₂培養箱中孵育20小時，每孔加入MTT(5mg/ml)20μL，繼續培養4小時，之后離心，棄上清，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，振蕩5分鐘，待沉淀物完全溶解后用酶聯免疫檢測儀測波長490nm時的OD值，計算TIL細胞的殺傷率。公式如下：殺傷率(％)＝[OD(靶)+OD(效)-OD(效+靶)]/OD(靶)×100％。結果如表5和圖6所示。

本實施例中進行細胞培養的裝置為免疫細胞體外擴增裝置，所述裝置包括細胞培養袋1和承載所述細胞培養袋1的承載臺3，該裝置還包括容納于所述細胞培養袋1中的磁性浮球2以及在懸掛于所述細胞培養袋1上方并且能夠驅動所述磁性浮球2在所述細胞培養袋1中移動的磁性懸掛驅動器4，所述磁性懸掛驅動器4包括能夠吸引所述磁性浮球2的磁體片41和能夠懸掛且驅動所述磁體片41在所述細胞培養袋1上方移動的懸掛驅動架42。所述懸掛驅動架42包括固定連接在所述磁體片41上的懸臂43；所述懸臂43上開設有一個限位孔431和一個設置有內螺紋的驅動孔432；所述懸掛驅動架42還包括二個支撐架4311以及限位連接在所述支撐架4311上的限位桿4310和絲桿4320；所述限位桿4310可滑動地穿過所述限位孔431；所述絲桿4320上設置有與所述驅動孔432的內螺紋匹配的外螺紋并螺旋穿過所述驅動孔432，且所述絲桿4320能夠通過繞軸線轉動驅動所述懸臂43沿所述限位桿4310滑動。電動機4321驅動所述絲桿4320進行軸向轉動。所述細胞培養袋1上開設有可封閉的進氣口11、出氣口12、進液口13和出液口14。所述出氣口12和所述出液口14上設置有能夠阻止細胞通過的篩網。所述細胞培養袋1的內部還設置有模擬血管瓣膜的人工瓣膜片15。所述承載臺3包括能夠維持細胞培養恒溫的恒溫托盤31和支撐所述恒溫托盤31的底座32。在細胞培養過程中，所述磁性浮球2不與所述細胞培養袋1的壁接觸，所述磁性浮球2的二分之一至十分之一的部分位于所述細胞培養袋1中的細胞培養液液面以上且剩余部分位于液面以下。所述磁性浮球2的外殼為具有生物相容性的外殼，且所述磁性浮球2中設置有用于提供浮力的空腔。

所述免疫細胞體外擴增裝置的切向示意圖如圖1所示、俯視示意圖如圖2所示，懸掛驅動架部件示意圖如圖3所示。

表1

實施例2

用實施例1的方法進行TIL細胞體外培養，區別僅在于，所使用的各培養基的組成成分如表2所示。檢測細胞的擴增倍數、各類細胞數量百分比如表5和圖4、5所示，TIL細胞的殺傷率結果如表5和圖6所示。

表2

實施例3

用實施例1的方法進行TIL細胞體外培養，區別僅在于，所使用的各培養基的組成成分如表3所示。檢測細胞的擴增倍數、各類細胞數量百分比如表5和圖4、5所示，TIL細胞的殺傷率結果如表5和圖6所示。

表3

實施例4

用實施例1的方法進行TIL細胞體外培養，區別僅在于，增殖培養基中不添加IL-12。檢測細胞的擴增倍數、各類細胞數量百分比如表5和圖4、5所示，TIL細胞的殺傷率結果如表5和圖6所示。

實施例5

用實施例1的方法進行TIL細胞體外培養，區別僅在于，培養不使用本公開所述的免疫細胞體外擴增裝置，改為在常規T25細胞培養瓶中進行培養。檢測細胞的擴增倍數、純度結果如表5和圖4、5所示，TIL細胞的殺傷率結果如表5和圖6所示。

對比例1

按照表4中給出的培養基成分配制培養基。無菌條件下，收集臨床診斷為肺癌患者的胸腹水1000mL，加入12U/mL的肝素鈉；將添加有肝素鈉的胸腹水離心收集細胞沉淀，用Ficoll分離液進行密度梯度離心收集分層液界面上的單個核細胞，用AIM-V無血清培養基洗滌2次后用基礎培養基重懸(AIM-V培養基與RPMI-1640培養基的體積比為1：0.8)獲得細胞懸液，用免疫磁珠對細胞懸液進行分選，收集TIL細胞。將TIL細胞調整細胞密度至5×10⁵個/mL，在本公開所述的免疫細胞體外擴增裝置中進行細胞培養，在5％CO₂，37℃的環境下培養14天，每兩天傳代換液一次，培養結束后檢測細胞的擴增倍數、純度和殺傷率。檢測細胞的擴增倍數、各類細胞數量百分比如表5和圖4、5所示，TIL細胞的殺傷率結果如表5和圖6所示。

表4

對比例2

用實施例1的方法進行TIL細胞體外培養，區別僅在于，不進行活化適應培養。檢測細胞的擴增倍數、純度和殺傷率。檢測細胞的擴增倍數、各類細胞數量百分比如表5和圖4、5所示，TIL細胞的殺傷率結果如表5和圖6所示。

對比例3

用實施例1的方法進行TIL細胞體外培養，區別僅在于，培養基組合中不添加RPMI-1640培養基，僅使用AIM-V培養基。檢測細胞的擴增倍數、純度和殺傷率。檢測細胞的擴增倍數、各類細胞數量百分比如表5和圖4、5所示，TIL細胞的殺傷率結果如表5和圖6所示。

表5

通過以上實施例可以看出，利用本公開所提供的TIL細胞體外培養基組合和培養方法進行TIL細胞體外培養，擴增倍數可以高達227倍，其中，CD3⁺細胞的含量可以達到99.63％，CD3⁺CD8⁺細胞的含量可以達到79.86％，Treg的含量僅為2.46％。效靶比20:1時殺傷率可以達到76.31％。

并且，優選在本公開所述的免疫細胞體外擴增裝置中進行細胞培養時，能獲得更高的TIL細胞擴增倍數和殺傷率，擴增的Treg細胞更少。

并且，優選在增殖培養基中添加IL-7、IL-12和IL-15的情況下，能獲得更高的TIL細胞擴增倍數和殺傷率，擴增的Treg細胞更少。

并且，優選培養基組合中含有RPMI-1640培養基時能獲得更高的TIL細胞擴增倍數和殺傷率，擴增的Treg細胞更少。

以上結合附圖詳細描述了本公開的優選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節，在本公開的技術構思范圍內，可以對本公開的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應當視為本公開所公開的內容。