本發明涉及醫用生物材料領域，具體為一種提取I型膠原蛋白的方法。
背景技術：
膠原蛋白是哺乳動物體內含量最豐富的蛋白質，占體內蛋白質總量的25%~30%。膠原蛋白是結締組織普遍存在的成分，是器官和組織必不可少的構造骨架，目前已經發現27種以上不同類型的膠原蛋白。I型膠原蛋白廣泛存在于動物的骨、角膜、皮膚、肌腱等組織中，分子量約300KD，其分子長度約為300nm，直徑約1.5nm，呈棒狀。顯微結構上I型膠原蛋白由三條肽鏈組成，包括兩條α(I)鏈和一條α(II)鏈。由于I型膠原蛋白具有可降解性、生物相容性和止血性等許多優良的生物學特性，因此被作為天然生物材料廣泛應用于生物醫學和組織工程學領域。
目前市場上出售的I型膠原蛋白主要從動物皮和跟腱組織中提取制備而成，由于現有的提取方法制備出的I型膠原蛋白受工藝條件的影響，提取產率較低，而且提取的膠原蛋白中含有的雜蛋白較多，嚴重影響膠原蛋白的質量，而在生物醫學和化妝品行業等領域的廣泛應用I型膠原蛋白的需求量與日俱增，因此，因此設計一種I型膠原蛋白提取方法以提高膠原蛋白的提取產率來滿足I型膠原蛋白在在生物醫學和化妝品行業等領域的應用顯得十分必要。
本發明以動物跟腱組織為原料，采用酸性酶法技術制備出一種I型膠原蛋白。該方法不僅可以提高I型膠原蛋白的提取產率，而且提取的I型膠原蛋白的雜蛋白含量較低。本發明提取的I型膠原蛋白具有優良的生物相容性和生物活性，能夠適應生物醫學的應用，同時能夠活化上皮細胞，促進上皮細胞增生和膠原酶生成，使皮膚緊致有彈力，在化妝品領域具有重要的應用價值。
技術實現要素：
本發明的目的是為了提供一種提取I型膠原蛋白海綿的方法， 該制備工藝簡單，能夠提高I型膠原蛋白的提取產率，而且提取的I型膠原蛋白的雜蛋白含量較低。
本發明的目的可以通過以下技術方案來實現。
本發明以動物跟腱組織為原料，采用酸性酶法技術制備出一種I型膠原蛋白，其提取過程包括以下七個步驟：（1）將牛跟腱洗凈后冷凍切片；（2）配置溶液將跟腱切片消毒脫脂；（3）將跟腱切片在碳酸鈉溶液浸泡脫去雜蛋白后水洗至中性；（4）采用勻漿機對跟腱切片進行均將破碎；（5）向勻漿液中加入胃蛋白酶，15~25℃下攪拌消化；（6）將上清液進行鹽析處理，再將沉淀溶解后進行透析處理；（7）將透析后的膠原原液進行冷凍干燥即得I型膠原蛋白，取出后真空封裝。
實施的具體技術方案如下。
步驟一：清洗工藝
將新鮮的牛跟腱用超純水清洗干凈，采用手術刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中將牛跟腱冷凍至硬化，取出后沿著組織纖維方向將牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
步驟二：消毒脫脂工藝
稱取100g跟腱片置于消毒脫脂溶液中浸泡，機械攪拌，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗若干次。
步驟三：脫雜蛋白工藝
將消毒脫脂后的跟腱片用堿性溶液浸泡進行脫雜蛋白，機械攪拌，間隔6~8h更換一次堿性溶液，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗若干次至跟腱片表面為中性（pH值為7）。
步驟四：破碎工藝
將脫雜蛋白后的跟腱片放入絞肉機中絞碎，并將絞碎后的跟腱組織置于1000mL的酸性溶液中，采用勻漿機對其勻漿破碎若干次，每次勻漿5min。
步驟五：酶解消化工藝
將勻漿液置于大容量的不銹鋼容器中，繼續向勻漿液中加入1000mL酸性溶液，再向其中加入適量的活性酶，攪拌消化，離心15~30min。取上清液備用。
步驟六：鹽析透析工藝
使用氫氧化鈉溶液將上清液中和至溶液呈中性，加入氯化鈉進行攪拌鹽析，離心15~30min，沉淀即為I型膠原蛋白初品，用超純水沖洗沉淀若干次，瀝干。將瀝干的沉淀溶解于透析液中進行透析。
步驟七：干燥工藝
將透析后的膠原原液在-50℃進行干燥處理，取出后真空封裝。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法所有步驟所使用的溶液及超純水溫度均為15~25℃。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法步驟二中的消毒脫脂溶液為75%酒精和正己烷的混合溶液，75%乙醇與正己烷的體積比為1:1~5:1，優選75%乙醇：正己烷=3:1；消毒脫脂時間為6~24h，優選時間為12h。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法步驟三中的脫雜蛋白的堿性溶液是選氫氧化鈉、經氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸氫鈉中任意一種配制的溶液，優選碳酸鈉；碳酸鈉溶液的濃度為0.01~1.0mol/L，優選濃度為0.05mol/L。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法步驟四中的酸性溶液為乙酸溶液和檸檬酸溶液中的任意一種或兩種，優選乙酸溶液；溶液的濃度為0.01%~2.0%（質量分數），優選濃度為0.5%（質量分數）。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法步驟五中的活性酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶和無花果蛋白酶中任意一種或兩種及以上，優選胃蛋白酶；活性酶的濃度為20~1000mg/L，優選濃度為100mg/L；消化時間12~72h，優選消化時間為24h。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法步驟六中的氯化鈉濃度為1~5mol/L，優選濃度2 mol/L；鹽析時間為1~24h，優選鹽析時間為12h。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法步驟六中的透析液為乙酸溶液，濃度為0.01mol/L；透析外液為0.001 mol/L的乙酸溶液或超純水，優選超純水。
所述的一種提取I型膠原蛋白的方法步驟七中的干燥方式是輻射干燥或冷凍干燥，優選冷凍干燥；冷凍干燥溫度為-50℃；冷凍干燥時間為24~72h，優選時間為48h。
本發明提供的優點如下：（1）本發明提供的一種提取I型膠原蛋白的方法提高了I型膠原蛋白的提取產率，且膠原蛋白中雜蛋白的含量較少。（2）本發明提取的I型膠原蛋白具有良好的生物相容性和生物活性，還能夠促進上皮細胞的增生和膠原酶的生成，滿足臨床生物醫學工程領域和化妝品行業的需求。（3）本發明的制備工藝簡單、可實現大規模生產，是一種經濟有效的提取方法。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發明作進一步說明。
實施案例1
（1）清洗工藝：將新鮮的牛跟腱用超純水清洗干凈，采用手術刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中將牛跟腱冷凍至硬化，取出后沿著組織纖維方向將牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
（2）消毒脫脂工藝：稱取100g跟腱片于75%乙醇：正己烷=3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液溫度15~25℃，機械攪拌，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗5次。
（3）脫雜蛋白工藝：用0.05mol/L碳酸鈉溶液浸泡24h，溶液溫度15~25℃，機械攪拌，間隔8h更換一次碳酸鈉溶液，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗數次至跟腱片表面為中性（pH值為7）。
（4）破碎工藝：將脫雜蛋白后的跟腱片放入絞肉機中絞碎，將絞碎后的跟腱組織置于1000mL的0.5%（質量分數）乙酸溶液，溶液溫度15~25℃，采用勻漿機對其勻漿破碎5次，每次勻漿5min。
（5）酶解消化工藝：將勻漿液至于大容量的不銹鋼容器中，繼續向勻漿液中加入1000mL 0.5%（質量分數）的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶濃度為100mg/L， 15~25℃下攪拌消化24h，離心15~30min。取上清液備用。
（6）鹽析透析工藝：使用1mol/L 氫氧化鈉溶液將上清液中和至溶液呈中性，加入氯化鈉至氯化鈉濃度為2mol/L，攪拌鹽析12h，離心15~30min，沉淀即為I型膠原蛋白初品，用超純水沖洗沉淀3次，瀝干備用。將瀝干的沉淀溶解于0.01mol/L乙酸溶液中，以超純水作為透析外液進行透析，透析液溫度15~25℃。
（7）干燥工藝：將透析后的膠原原液置于冷凍干燥機中在-50℃下冷凍干燥48h，取出后真空封裝。
對實施案例1所提取的I型膠原蛋白進行力學產率檢測，經檢測，實施例1中I型膠原蛋白的提取產率達到82.6%。
實施案例2
（1）清洗工藝：將新鮮的牛跟腱用超純水清洗干凈，采用手術刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中將牛跟腱冷凍至硬化，取出后沿著組織纖維方向將牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
（2）消毒脫脂工藝：稱取100g跟腱片于75%乙醇：正己烷=3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液溫度15~25℃，機械攪拌，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗5次。
（3）脫雜蛋白工藝：用0.5mol/L碳酸鈉溶液浸泡24h，溶液溫度15~25℃，機械攪拌，間隔8h更換一次碳酸鈉溶液，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗數次至跟腱片表面為中性（pH值為7）。
（4）破碎工藝：將脫雜蛋白后的跟腱片放入絞肉機中絞碎，將絞碎后的跟腱組織置于1000mL的0.5%（質量分數）乙酸溶液，溶液溫度15~25℃，采用勻漿機對其勻漿破碎5次，每次勻漿5min。
（5）酶解消化工藝：將勻漿液至于大容量的不銹鋼容器中，繼續向勻漿液中加入1000mL 0.5%（質量分數）的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶濃度為100mg/L， 15~25℃下攪拌消化24h，離心15~30min。取上清液備用。
（6）鹽析透析工藝：使用1mol/L 氫氧化鈉溶液將上清液中和至溶液呈中性，加入氯化鈉至氯化鈉濃度為2mol/L，攪拌鹽析12h，離心15~30min，沉淀即為I型膠原蛋白初品，用超純水沖洗沉淀3次，瀝干備用。將瀝干的沉淀溶解于0.01mol/L乙酸溶液中，以超純水作為透析外液進行透析，透析液溫度15~25℃。
（7）干燥工藝：將透析后的膠原原液置于冷凍干燥機中在-50℃下冷凍干燥48h，取出后真空封裝。
實施案例3
（1）清洗工藝：將新鮮的牛跟腱用超純水清洗干凈，采用手術刀片剔除筋膜、碎骨、廋肉和脂肪，在-20℃冰箱中將牛跟腱冷凍至硬化，取出后沿著組織纖維方向將牛跟腱切成1mm厚度的跟腱片。
（2）消毒脫脂工藝：稱取100g跟腱片于75%乙醇：正己烷=3:1的混合溶液中浸泡12h，溶液溫度15~25℃，機械攪拌，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗5次。
（3）脫雜蛋白工藝：用0.05mol/L碳酸鈉溶液浸泡24h，溶液溫度15~25℃，機械攪拌，間隔8h更換一次碳酸鈉溶液，采用不銹鋼絲網濾去溶液，取出后用超純水清洗數次至跟腱片表面為中性（pH值為7）。
（4）破碎工藝：將脫雜蛋白后的跟腱片放入絞肉機中絞碎，將絞碎后的跟腱組織置于1000mL的0.5%（質量分數）乙酸溶液，溶液溫度15~25℃，采用勻漿機對其勻漿破碎5次，每次勻漿5min。
（5）酶解消化工藝：將勻漿液至于大容量的不銹鋼容器中，繼續向勻漿液中加入1000mL 0.5%（質量分數）的乙酸溶液，再向其中加入胃蛋白酶，胃蛋白酶濃度為200mg/L， 15~25℃下攪拌消化24h，離心15~30min。取上清液備用。
（6）鹽析透析工藝：使用1mol/L 氫氧化鈉溶液將上清液中和至溶液呈中性，加入氯化鈉至氯化鈉濃度為2mol/L，攪拌鹽析12h，離心15~30min，沉淀即為I型膠原蛋白初品，用超純水沖洗沉淀3次，瀝干備用。將瀝干的沉淀溶解于0.01mol/L乙酸溶液中，以超純水作為透析外液進行透析，透析液溫度15~25℃。
（7）干燥工藝：將透析后的膠原原液置于冷凍干燥機中在-50℃下冷凍干燥48h，取出后真空封裝。
以上內容是結合具體的實施方式對本發明所作的詳細說明，不能認定本發明具體實施僅限于以上說明。在不背離本發明的構思下，本領域的技術人員根據本發明做出的各種修飾和替換，都應當視為本發明的保護范圍。