本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種植物乳桿菌凍干粉的制備方法。
背景技術：
：在人的腸道中存在著幾百種、數百億個細菌，在腸內構成菌叢。迄今為止，人們已知這些腸道細菌分三類：一類是能夠合成某些維生素、對有害細菌的增殖有抑制作用、對免疫功能有刺激和促進的效果，這就是以雙歧桿菌和乳桿菌為主的有益菌，這些細菌通過調整腸道生態系統可保持人體的健康，減少疾病，延緩衰老，因此被稱為益生菌；另一類是在腸道內會構成腐敗、產生有害或致癌物質的有害菌，如梭狀芽胞桿菌、擬桿菌屬和真細菌屬等；另外還有一類既有有害作用，又有有益作用的細菌，如胨球菌。植物乳桿菌是益生菌的一種，圓端直桿菌，通常為0.9-1.2μm×3.0-8.0μm，單個、成對或成短鏈；通常缺乏鞭毛，但能運動；革蘭氏陽性，不生芽孢；厭氧或兼性厭氧，表面菌落直徑約3mm，凸起，圓，光滑，細密，色白，偶爾呈淺黃或深黃色；能產生DL-乳酸，有1,6-二磷酸果糖醛縮酶和單磷酸己糖途徑的活性，能在葡萄酸鹽中生長，并產CO2；發酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，此菌與其他乳酸菌的區別在于此菌的活菌數比較高。植物乳桿菌具有很多的保健作用：①有一定的免疫調節作用；②對致病菌有抑制作用；③降低血清膽固醇含量和預防心血管疾病；④維持腸道內菌群平衡；⑤促進營養物質吸收；⑥緩解乳糖不耐癥；⑦抑制腫瘤細胞的形成等。基于植物乳桿菌對人體的多種功用及高活菌數的特性，越來越多的企業利用植物乳桿菌凍干粉為原料生產生物制品和健康食品，那么單位產品活菌數就直接影響產品的功效。因此，在凍干粉生產制備過程中提高活菌數就尤為重要。技術實現要素：本發明目的是提供一種植物乳桿菌凍干粉的制備方法，達到植物乳桿菌增殖培養、凍干粉活菌數量大、菌體收率高的目的。本發明采用的技術方案為：一種植物乳桿菌凍干粉的制備方法，包括如下步驟：1)菌種劃線培養：將植物乳桿菌菌粉用無菌水稀釋后，于MC培養基上分區劃線，劃線結束后，平皿倒置，35℃培養箱恒溫培養40～72小時；2)一級純化培養：挑取平皿上溶鈣圈較大的單菌落接種至裝有MRS液體培養基的試管中，試管密封，35℃培養箱恒溫靜置培養15～20小時；3)二級純化培養：按3～5％接種量，將一級純化培養好的菌懸液接種至裝有MRS液體培養基的三角瓶中，三角瓶密封，35℃培養箱恒溫靜置培養15～20小時；4)菌種保存：對二級純化培養得到的菌懸液進行離心，12000rpm離心10分鐘后得到菌泥，將菌泥溶解于混合液中，得菌泥混合液，將菌泥混合液分裝在已滅菌的凍存管中，封口膜密封，凍存于-40～-80℃低溫冰箱內，得植物乳桿菌菌泥凍存管，備用；5)凍存菌種復蘇：取存于低溫冰箱內的植物乳桿菌菌泥凍存管，立即放入35℃水浴鍋內進行菌種復蘇，30～45s，至凍存管內液體全部融化；6)菌種一級培養：將復蘇好的1～2ml菌泥混合液直接接種至裝有基礎培養基的三角瓶A中，三角瓶密封，35℃培養箱恒溫靜置培養16～24小時；7)菌種二級培養：按照2～6％接種量，將一級培養結束的菌懸液接種至裝有基礎培養基的三角瓶中B，三角瓶密封，35℃培養箱恒溫靜置培養16～24小時；8)菌種三級培養：按照2～6％接種量，將二級培養結束的菌懸液接種至裝有基礎培養基的發酵罐中，開啟發酵罐攪拌槳，轉速為100rpm，通氣量為0，35℃恒溫培養7～12小時；9)菌種四級發酵：按照2～8％接種量，將三級培養結束的菌懸液接種至裝有優化培養基的發酵罐中，開啟發酵罐攪拌槳，轉速為100rpm，通氣量為0，35℃恒溫培養，在發酵開始3小時后，通過流加食品級NaOH溶液來維持恒定pH為4.80～5.30，培養周期6～12小時，直至監測到菌液OD600值停止增長或呈負增長，立即停止發酵；10)發酵液離心：四級發酵結束后，將發酵罐罐體溫度調低，當罐內發酵液溫度低于20℃時準備離心，離心設備采用管式離心機，離心前對轉鼓進行蒸汽滅菌30min，離心轉速為10000～15000rpm；11)菌泥收集：離心結束后，收集轉鼓內的菌泥；12)凍干保護劑添加，菌泥收集完畢后，按照菌泥：凍干保護劑＝1:1～2的質量體積比，添加凍干保護劑，并攪拌、得到混合均勻的菌液；13)冷凍干燥：將混合均勻的菌粉，分裝到凍干機托盤中，然后將凍干機托盤放入凍干機內進行菌粉的凍干，真空度0～1.0Pa，溫度－25℃，持續凍干43～58小時；14)凍干粉收集；15)粉碎、包裝：按質量要求進行粉碎后包裝。所述的制備方法，步驟3)中MRS液體培養基的體積占三角瓶容積的40％～60％。所述的制備方法，步驟4)中混合液與離心前二級純化培養得到的菌懸液的體積比為1:10。所述的制備方法，步驟4)中混合液由MRS液體培養基與50％甘油溶液按體積比為1:1～1.5的比例配制混合而成。所述的制備方法，步驟7)中基礎培養基的體積占三角瓶B容積的40％～60％；步驟8)中基礎培養基的體積占發酵罐容積的40％～60％。所述的制備方法，步驟6)、7)、8)中基礎培養基的配制，按照配方比例為：酵母蛋白胨8.0～15.0g/L、葡萄糖15.0～25.0g/L、酵母浸出物3.0～6.0g/L、乙酸鈉4.0～6.0g/L、硫酸鎂0.1～0.6g/L、吐溫800.5～0.75g/L、磷酸二氫鉀1.5～3.0g/L、余量為無菌水，稱量各組分，混合、加熱溶解，用1mol/L食品級NaOH溶液調培養基pH值至6.20～6.60，于115℃下滅菌30min。所述的制備方法，步驟9)中優化培養基裝液的體積占發酵罐容積的40％～60％。所述的制備方法，步驟9)中優化培養基的配制，按照配方比例為：酵母蛋白胨13.0～18.0g/L、葡萄糖25.0～35.0g/L、酵母浸出物8.0～12.0g/L、乙酸鈉8.0～12.0g/L、硫酸鎂0.1～0.2g/L、吐溫800.5～0.75g/L、磷酸二氫鉀1.5～3.0g/L、余量為無菌水，稱量各組分，混合、加熱溶解，用1mol/L食品級NaOH溶液調培養基pH值至6.20～6.60，115℃下滅菌30min。所述的制備方法，步驟12)中凍干保護劑的配制，按照比例為：脫脂奶粉60.0～100.0g/L、麥芽糊精20.0～40.0g/L、海藻糖80.0～200.0g/L、吐溫800.5～0.75g/L、甘油8.0～12.0g/L、谷氨酸鈉0.8～1.5g/L、抗壞血酸鈉0.8～1.5g/L、余量為無菌水，對各組分進行稱量、混、溶解，于115℃滅菌30min，待溫度降至室溫后，冷藏于-4℃冰箱內備用。與現有技術相比，本發明具有以下突出的優點：1、本發明為實現植物乳桿菌增殖培養、富集高活菌數的菌體用于生產作為食品添加劑的凍干粉目的，針對植物乳桿菌純化培養和菌種發酵分別采用了不同的、更適于菌體不同生長階段的基礎培養基和優化培養基，并且培養基采用的組分原料均為食品級。2、在本發明中，用于發酵的菌種采用離心菌泥凍存的保存方式，較于現在普遍應用的斜面和菌懸液直接凍存的方式，獲得的菌懸液的收率和活菌數更高。3、采取分級擴大培養方式促使菌體數量快速增加，通過流加食品級NaOH溶液來控制發酵過程中pH恒定，在短時間里得到大量的菌體，并且菌種穩定，變異、退化少。4、采用管式離心機分離收集植物乳桿菌菌泥，菌泥收率可達到1.5％以上，活菌數高達1012CFU/g以上，并且管式離心機的轉鼓可用蒸汽滅菌，有效地防止了在離心過程中染菌。5、利用冷凍干燥技術生產活菌制劑有許多突出的優點：①由于在低溫下干燥，微生物不會失去生物活性；②在低溫干燥過程中，微生物的生長和酶的作用幾乎無法進行，能最好地保持被凍干物質的原來性狀；③干燥后體積、形狀基本不變；④被凍干制品呈海綿狀，不干縮，因而溶解時與水接觸面大，能迅速恢復原來的性狀；⑤能除去物質中95％-99％的水分，延長制品的保存期。6、為避免在冷凍干燥過程造成菌細胞膜的損傷，加入凍干保護劑，在凍干保護劑中脫脂奶粉主要在細胞表面起保護層作用；海藻糖在冷凍干燥過程中形成一種玻璃態，在玻璃態下黏度極高，因而分子擴散系數很低，使大分子物質運動受阻，細胞壁的通透性降低，從而起到保護作用；抗壞血酸鈉是一種水溶性極強的抗氧化劑，能使植物乳桿菌在凍干過程中免遭氧氣的影響，保持細胞活性并提高穩定性；甘油和谷氨酸鈉能滲透到細胞內部，可改善凍干過程中冰晶生成的速度和膜的滲透性；麥芽糊精有利于提高在冷凍干燥后的菌體成活率以及儲存過程中的菌體成活率，同時還能提高菌粉的速溶性；吐溫80作為表面活性劑可防止蛋白質變性，冷凍時冰-水界面的形成可引起蛋白質表面誘導變性，表面活性劑可使蛋白質溶液表面張力下降，減少冰-水界面蛋白質吸收和聚集的驅動力。復配保護劑體系中每種保護劑成分在冷凍干燥過程中都發揮各自的作用，同時相互間又具有協同作用。7、本發明技術制備的植物乳桿菌凍干粉，活菌數高，存活率高。附圖說明圖1為對比例1采用不同保存方式的菌種進行發酵對收率和活菌數影響的示意圖。圖2為對比例2采用不同基礎培養基配方對OD600和收率的影響的對比圖。圖3為對比例3采用不同優化培養基配方對活菌數和收率的影響的對比圖。圖4為實施例1一種植物乳桿菌凍干粉的制備方法流程圖。具體實施方式實施例1一種植物乳桿菌凍干粉的制備方法一、發酵用菌種的制備1)菌種劃線培養：植物乳桿菌菌粉用無菌水稀釋后，于MC培養基上四區劃線，劃線結束后，平皿倒置，35℃培養箱恒溫培養60小時；2)一級純化培養：挑取平皿上溶鈣圈較大的單菌落接種至裝有5mlMRS液體培養基的試管中，試管密封，35℃培養箱恒溫靜置培養15小時；3)二級純化培養：按3％接種量，將一級純化培養好的菌懸液接種至裝有100mlMRS液體培養基的250ml三角瓶中，三角瓶密封，35℃培養箱恒溫靜置培養20小時；4)菌種保存：對二級純化培養得到的100ml菌懸液進行離心，12000rpm離心10分鐘后得到菌泥，將菌泥溶解于10ml混合液(混合液由5mlMRS液體培養基與5ml50％甘油溶液混合均勻配制而成)中，得菌泥混合液，將菌泥混合液分裝在已滅菌的1ml凍存管中，封口膜密封，凍存于-80℃低溫冰箱內，得植物乳桿菌菌泥凍存管，備用；注：1)—4)操作均必需在無菌操作臺和無菌間內執行；二、菌種的發酵5)凍存菌種復蘇：取存于低溫冰箱內的植物乳桿菌菌泥凍存管，立即放入35℃水浴鍋內進行菌種復蘇，30～45s，至凍存管內液體全部融化；6)菌種一級培養：將復蘇好的1ml菌泥混合液直接接種至裝有10ml基礎培養基的50ml三角瓶中，三角瓶密封，35℃培養箱恒溫靜置培養20小時；7)菌種二級培養：按照2％接種量，將一級培養結束的菌懸液接種至裝有100ml基礎培養基的250ml三角瓶中，按此接種4瓶，三角瓶密封，35℃培養箱恒溫靜置培養20小時；8)菌種三級培養：按照5％接種量，將二級培養結束的菌懸液接種至裝有7.2L基礎培養基的12L發酵罐中，開啟發酵罐攪拌槳，轉速為100rpm，通氣量為0，35℃恒溫培養10小時；9)菌種四級發酵：按照5％接種量，將三級培養結束的菌懸液接種至裝有120L優化培養基的200L發酵罐中，開啟發酵罐攪拌槳，轉速為100rpm，通氣量為0，35℃恒溫培養，在發酵開始3小時后，通過流加食品級NaOH溶液來維持恒定pH為5.10±0.1，培養至10小時時，監測到菌液OD600值停止增長，立即停止發酵；其中：步驟6)、7)、8)基礎培養基的配方為：酵母蛋白胨8.0g/L、葡萄糖25.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、硫酸鎂0.3g/L、吐溫800.5g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.20。制備：按照配方比例稱量、加熱溶解，用1mol/L食品級NaOH溶液調培養基pH值至6.20，115℃下滅菌30min；步驟9)優化培養基配方：酵母蛋白胨18.0g/L、葡萄糖32.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、乙酸鈉10.0g/L、硫酸鎂0.1g/L、吐溫800.5g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、余量為無菌水，pH值6.20。制備：按照配方比例稱量、加熱溶解，用1mol/L食品級NaOH溶液調培養基pH值至6.20，115℃下滅菌30min；注：培養基中各組分原料均為食品級；三、凍干粉的制備10)發酵液離心：四級發酵結束后，將發酵罐罐體溫度調低，當罐內發酵液溫度低于20℃時準備離心，離心設備采用管式離心機，離心前對轉鼓進行蒸汽滅菌30min，離心轉速為12000rpm；11)菌泥收集，離心結束后，收集到轉鼓內的菌泥2.03kg，菌泥收率為1.69％；12)凍干保護劑添加，菌泥收集完畢后，按照菌泥(kg)：凍干保護劑(L)＝1:1～2的質量體積比，添加凍干保護劑，并攪拌、得到混合均勻的菌粉。按照凍干保護劑的配方配制2.5L凍干保護劑。其凍干保護劑的配方：脫脂奶粉75.0g/L、麥芽糊精25.0g/L、海藻糖150.0g/L、吐溫800.6g/L、甘油10.0g/L、谷氨酸鈉1.2g/L、抗壞血酸鈉1.2g/L、余量為無菌水。制備：按照比例對各組分進行稱量、溶解，于115℃滅菌30min，待溫度降至室溫后，冷藏于-4℃冰箱內備用。13)冷凍干燥：將混合均勻的菌粉，分裝到凍干機托盤中，然后將凍干機托盤放入凍干機內進行菌粉的凍干，真空度0～1.0Pa，溫度－25℃，持續凍干50小時；14)凍干粉收集，檢測活菌數為5.85×1011CFU/g；15)粉碎、包裝，按質量要求進行粉碎后包裝。注：5)—15)操作均需在10萬級凈化車間內進行。對比例1用于發酵的菌種保存方式的對比實驗實施例1中植物乳桿菌經步驟1)菌種劃線培養、步驟2)一級純化培養、步驟3)二級純化培養后的菌懸液，分別以斜面、菌懸液和采用實施例1步驟4)的菌泥保存方式進行凍存，然后分別以這三種保存方式凍存的菌種采用相同的培養條件進行同實施例1步驟5)-10)的發酵，然后分別測定發酵結束離心后得到的菌泥的活菌數和收率，結果如圖1所示。其活菌數的測定方法：采用平板計數法；收率的測定方法如下：由圖1顯示可知：采用實施例1中離心菌泥方式保存的菌種進行發酵，活菌數和收率均高于斜面和菌懸液保存方式。對比例2基礎培養基配方的對比實驗配方A：酵母蛋白胨8.0g/L、牛肉粉0.6％、葡萄糖25.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.3g/L、吐溫800.5g/L、余量為無菌水。配方B：酵母蛋白胨8.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、葡萄糖25.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.3g/L、吐溫800.5g/L、硫酸錳0.008％、余量為無菌水。配方C(實施例1配方)：酵母蛋白胨8.0g/L、酵母浸出物4.0g/L、葡萄糖25.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.3g/L、吐溫800.5g/L、余量為無菌水。分別按照配方A、B和C配制基礎培養基，并在與實施例1相同的培養條件下培養植物乳桿菌，三級培養結束后，檢測菌懸液的OD600和收率，結果如圖2所示。由圖2顯示可知，基礎培養基采用配方C即實施例1配方培養植物乳桿菌，培養結束后測得菌懸液的OD600和收率均高于配方A和配方B。對比例3優化培養基配方的對比實驗配方Ⅰ：魚蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸鈉10.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.10g/L、吐溫800.5g/L、余量為無菌水。配方Ⅱ：牛骨蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸鈉10.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.10g/L、吐溫800.5g/L、余量為無菌水。配方III：酪蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸鈉10.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.10g/L、吐溫800.5g/L、余量為無菌水。配方IV(實施例1配方)：酵母蛋白胨18.0g/L、酵母浸出物12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸鈉10.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.1g/L、吐溫800.5g/L、余量為無菌水。配方Ⅴ：酵母蛋白胨18.0g/L、牛肉粉12.0g/L、葡萄糖32.0g/L、乙酸鈉10.0g/L、磷酸二氫鉀3.0g/L、硫酸鎂0.10g/L、吐溫800.5g/L、余量為無菌水。分別按照配方Ⅰ、Ⅱ、III、IV和Ⅴ配制優化培養基，并在與實施例1相同的培養條件下進行植物乳桿菌發酵，四級發酵結束后，檢測菌懸液的活菌數和收率，結果如圖3所示。由圖3可知，優化培養基采用配方IV即實施例1配方進行植物乳桿菌發酵，發酵結束后測得菌懸液的活菌數和收率均高于配方Ⅰ、Ⅱ、III和Ⅴ。對比例4凍干保護劑配方的對比實驗配方①：菊粉225g/L、谷氨酸鈉12.5g/L、甘油45g/L；配方②：脫脂奶粉75.0g/L、蔗糖75.0g/L、葡萄糖75.0g/L、谷氨酸鈉1.2g/L、抗壞血酸鈉1.2g/L、吐溫800.6g/L、甘油10.0g/L、麥芽糊精25.0g/L、余量為無菌水；配方③：脫脂奶粉75.0g/L、海藻糖150.0g/L、谷氨酸鈉1.2g/L、吐溫800.6g/L、甘油10.0g/L、麥芽糊精25.0g/L、余量為無菌水；配方④：脫脂奶粉75.0g/L、海藻糖150.0g/L、谷氨酸鈉1.2g/L、抗壞血酸鈉1.2g/L、吐溫800.6g/L、余量為無菌水；配方⑤(實施例1配方)：脫脂奶粉75.0g/L、海藻糖150.0g/L、谷氨酸鈉1.2g/L、抗壞血酸鈉1.2g/L、吐溫800.6g/L、甘油10.0g/L、麥芽糊精25.0g/L、余量為無菌水。按照配方①、②、③、④和⑤分別配制凍干保護劑，經115℃滅菌30min后，觀察保護劑的顏色狀態(如表1)，由于配方①呈橙黃色，顏色較深，所以不能使用。然后，分別采用配方②、③、④和⑤凍干保護劑在相同的冷凍干燥條件下對同一菌泥進行冷凍干燥，冷凍干燥結束后，通過檢測冷凍干燥前后活菌數計算其存活率，結果見表1。由表1可知：采用實施例1凍干保護劑制得的植物乳桿菌凍干粉，菌體存活率遠高于其他3種凍干保護劑。表1不同配方的凍干保護劑經滅菌后顏色狀態的差別及對凍干粉存活率的影響保護劑配方編號顏色狀態存活率/％配方①橙黃色，溶液——配方②乳白色，溶液44.4配方③乳白色，溶液44.7配方④乳白色，溶液64.5配方⑤乳白色，溶液75.5當前第1頁1 2 3