本發明涉及緩釋制劑領域，特別涉及生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑及制備方法和應用。

背景技術：

食管癌是起源于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內食管癌的發病率在惡性腫瘤中居第8位，死亡率為第6位。我國是食管癌最高發的國家之一，國內每年食管癌新發病例超過22萬例，死亡約20萬例，通常食管癌患者確診時已進展至中晚期，總體5年生存率不足20％，而早期食管癌通常經內鏡下微創治療即可根治，5年生存率可超過95％。目前，內鏡下粘膜切除術(Endoscopic mucosal resection EMR)和內鏡下粘膜剝離術(endoscopic submucosal dissection ESD)是早期食管癌的主要治療方式。但是，EMR和ESD通常會破壞患者食管粘膜層，導致食管狹窄。研究表明，大于四分之三周的食管粘膜剝離，術后食管狹窄的發生率即高達88-100％，對患者的生活質量造成嚴重的影響。

通過機械方法擴張狹窄部位，能夠在較短時間內為患者解除痛苦。但是，食管狹窄容易復發，需進行多次介入治療，這無疑會增加消化道內壁的損傷和并發癥的發生，導致瘢痕形成，形成食管狹窄。食管狹窄是由于固有肌層的破壞和纖維化導致的，黏膜層炎癥反應的缺失將會避免固有肌層的損害及過度纖維化從而預防食管狹窄。類固醇激素能減少脯氨酰羥化酶的活化，促進膠原酶的激活來減輕炎癥反應從而減少組織膠原的含量。基于這一理念，發現ESD術后內鏡下曲安奈德的注射可以有效預防食管狹窄的發生。但是，局部類固醇藥物的注射往往需要在介入設備的輔助下多次用藥，這無疑會增加患者的痛苦和經濟負擔，不同手術的創面范圍、注射方式和注射劑量，也會帶來不一樣的療效，同時，多次注射會有穿刺出血的風險。

技術實現要素：

針對上述現有技術中存在的問題，本發明提供了生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑及制備方法和應用，通過內鏡直接噴涂緩釋劑在消化道相應手術區域處，能發揮持久抗炎作用，減少術后瘢痕形成，預防術后食管狹窄，有效改善患者生活質量。

本發明提供的一種技術方案是：一種生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑，緩釋劑包含生物蛋白膠、抑肽酶、曲安奈德，其中，生物蛋白膠的質量分數為1.8％～4.0％，抑肽酶的質量分數為0.08％～0.10％，曲安奈德的質量分數為0.09％～0.33％。

上述緩釋劑的制備方法，具有以下步驟，

1)取抑肽酶，溶解配置成質量濃度為10％的抑肽酶溶液；

2)取曲安奈德，溶解配置成濃度為10mg/ml的曲安奈德溶液；

3)分別配置生物蛋白主體膠溶液、催化劑溶液，其中，生物蛋白主體膠溶液濃度為50～90mg/ml，催化劑溶液濃度為500IU/ml；

4)取1體積步驟3)配置的生物蛋白主體膠溶液、0.01體積步驟1)配置的抑肽酶溶液、0.125～0.375體積步驟2)配置的曲安奈德溶液，混勻；

5)取1體積步驟3)配置的催化劑溶液、0.01體積步驟1)配置的抑肽酶溶液、0.125～0.375體積步驟2)配置的曲安奈德溶液，混勻；

6)將步驟4)、步驟5)的混合液混合，凝結，得到生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。

上述步驟1)用生理鹽水溶解抑肽酶，步驟2)用滅菌注射用水溶液曲安奈德。

上述緩釋劑在制備模擬生物體內緩釋曲安奈德制劑的用途。

本發明提供的另一種技術方案是：一種生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑，緩釋劑包括生物蛋白膠、曲安奈德，其中，生物蛋白膠的質量分數為2.5％～4.5％，曲安奈德的質量分數為0.13％～0.38％。

上述緩釋劑的制備方法，有以下步驟：

1)取曲安奈德，溶解配置成濃度為10mg/ml的曲安奈德溶液；

2)用步驟1)配置的曲安奈德溶液作溶劑，配置濃度為50～90mg/ml的生物蛋白主體膠溶液；

3)配置濃度為500IU/ml的催化劑溶液；

4)將步驟2)所得生物蛋白主體膠溶液與步驟3)所得催化劑溶液等體積混合，凝結，得到生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。

上述步驟1)用滅菌注射用水溶解曲安奈德。

上述緩釋劑在制備用于防治消化道內鏡治療術后狹窄的制劑中的用途。

本發明具有以下有益效果：

生物蛋白膠提取自生物組織內，由纖維蛋白原、凝血因子及凝血酶等多種可凝性蛋白組成，其本身具有止血、封閉創面、黏合裂口、促進愈合的作用。生物蛋白膠植入體內后，根據局部纖溶活性及生物蛋白膠體積，可在8～18d內被組織降解吸收，毒副作用較小，不存在異物殘留問題，避免了某些生物材料植入后需二次手術取出的問題。

曲安奈德屬于類固醇激素，被應用于預防食管ESD術后狹窄。

將曲安奈德與生物蛋白主體膠混勻后，再與催化劑混合，模擬發生生物體凝血反應，形成凝膠狀的纖維蛋白多聚體，曲安奈德均勻分布在該纖維蛋白多聚體內。纖維蛋白多聚體具有穩定及特定的海綿狀三維結構，表面積較大，可延長自身溶解時間與曲安奈德釋放時間，在三維結構內構建成多個小室間，形成類似半透膜的結構，曲安奈德均勻分布在纖維蛋白多聚體的各小室間內，可順濃度梯度方向自半透膜不斷從小室間向外滲透，實現緩釋曲安奈德的目的，持續對患者手術區域處給藥，有效避免了傳統治療手段通過介入設備輔助多次用藥的缺陷。此外，生物蛋白膠還具有抗壓性、形狀可塑性等優點，結合消化道的管道特點，非常適合用于對消化道用藥。

當在生理鹽水中模擬生物體內緩釋曲安奈德時，制備緩釋劑過程中加入的抑肽酶用于減緩蛋白膠凝結速度，使曲安奈德均勻分布在生物蛋白膠內，能有效保證曲安奈德緩釋的平順性。

本發明制備得到的生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑，能發揮持久抗炎作用，減少術后瘢痕形成，有效預防食管術后狹窄，減少手術并發癥。為一次性給藥，減少患者接受治療的次數，減輕患者負擔，有效改善患者的生活質量。

本發明所用生物蛋白膠，購自上海萊士血液制品股份有限公司(催化劑：每瓶1000IU，2ml/瓶，主體膠：每瓶100-180mg，2ml/瓶)；醋酸曲安奈德注射液(5ml∶50mg)，購自天津金耀氨基酸有限公司；抑肽酶，購自上海雅心生物技術有限公司；THZ-9213型臺式恒溫振蕩器，購自上海躍進醫療器械廠；滅菌注射用水，購自四川科倫藥業股份有限公司；生理鹽水，購自西南藥業股份有限公司。

說明書附圖

圖1為色譜測定圖，圖中，A為生理鹽水+抑肽酶溶液的色譜圖，B為醋酸曲安奈德注射液的色譜圖，C為曲安奈德+生理鹽水+抑肽酶溶液的色譜圖；

圖2為緩釋劑在37℃生理鹽水中曲安奈德釋放曲線圖，圖中，A表示含2.5mg曲安奈德緩釋劑，B表示含5.0mg曲安奈德緩釋劑，C表示含7.5mg曲安奈德緩釋劑。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例一：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.125ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.125ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固地連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結形成生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑(含曲安奈德2.5mg)。

實施例二：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固地連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結形成生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑(含曲安奈德5.0mg)。

實施例三：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.375ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.375ml醋酸曲安奈德注射液，混勻；將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固的連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結形成生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑(含曲安奈德7.5mg)。

實施例四：制備生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑

1)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，取生物蛋白主體膠，用醋酸曲安奈德注射液作溶劑，溶解得到生物蛋白主體膠溶液；

2)配置催化劑溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

3)取配套的第一注射器，第二注射器，分別抽取等體積的步驟1)配置的生物蛋白主體膠溶液和步驟2)配置的催化劑溶液，將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固的連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結成白色膠凍樣的生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。

實施例五：制備生物蛋白膠空白對照組

1)配置抑肽酶溶液

取100mg抑肽酶，在無菌無酶環境中用900μl生理鹽水溶解，充分混勻，得到抑肽酶溶液；

2)配置生物蛋白主體膠溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的主體膠溶液溶解主體膠，得到生物蛋白主體膠溶液；

3)配置催化劑溶液

按照購買的醫用生物蛋白膠使用說明書，用配套的氯化鈣溶液溶解催化劑(凝血酶)，得到催化劑(凝血酶)溶液；

4)取配套的第一注射器，抽取步驟2)配置的生物蛋白主體膠溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml生理鹽水，混勻；取配套的第二注射器，抽取步驟3)配置的催化劑溶液1ml、步驟1)配置的抑肽酶溶液10μl、0.25ml生理鹽水，將第一注射器、第二注射器的錐頭部牢固的連接在連接針座上，再將各注射器的噴嘴安裝在連接針座的錐頭上，檢查無松動滲漏后，同時推擠第一注射器、第二注射器，注入準備好的透明薄袋里(透明薄袋底面積為2.0cm×2.0cm)，迅速凝結形成生物蛋白膠空白對照組(不含曲安奈德)。

體外緩釋實驗：

將實施例一、二、三、五制備得到的生物蛋白膠分別置于四個燒杯中，各燒杯分別加入生理鹽水5ml，用THZ-9213型臺式恒溫振蕩器于37℃恒溫振蕩，每隔12h(即12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h)吸取釋放液5ml，并補充生理鹽水5ml，繼續振蕩。

色譜分析：

色譜分析條件：色譜柱(Water×BridgeC18，4.6mm×15mm，5μm)；流動相為水：甲醇＝30∶70；進樣量：20μl；柱溫：30℃；檢測波長：240nm；流速：1ml/min。

專屬性試驗

按上述色譜分析條件分別色譜分析測定生理鹽水+抑肽酶溶液、醋酸曲安奈德注射液、曲安奈德+生理鹽水+抑肽酶溶液，并獲得如圖1所示色譜圖。通過觀察圖1所得色譜峰可知，本試驗方法特異性較好，曲安奈德保留時間約為8.6min，未檢測到其他物質對生物蛋白膠內曲安奈德測定的干擾。

線性曲線方程

分別用滅菌注射用水配置濃度(X)為0.05μg/ml、0.10μg/ml、1.00μg/ml、10.00μg/ml、50.00μg/ml的5個濃度梯度的曲安奈德溶液，按上述色譜分析條件進行色譜分析測定，以峰面積Y為應變量，濃度X(μg/ml)為自變量，通過線性回歸算得回歸方程：Y＝63362X-10006(r＝0.9999，n＝5)。將色譜峰面積帶入回歸方程計算相應濃度C，并計算濃度偏差(D＝(C-X)*100％)，以偏差在5％內確定最低檢測限。結果表明，曲安奈德在0.05～50μg/mL范圍內線性良好。

精密度實驗

用滅菌注射用水配置濃度為5μg/ml的曲安奈德溶液。按上述色譜分析條件進行色譜分析測定。單日內每隔3h測定3次，共測定3批；日間于每日同一時間測定3次，連續測定3d，其結果見表1。日內平均相對標準偏差(RSD)為0.95％，日間平均相對標準偏差(RSD)為0.77％。

表1：精密度測試結果 (n＝3)

穩定性實驗

任取體外緩釋實驗的同一釋放液，放入冰箱于4℃保溫，分別于0，2，4，6，8，10，15，20，30d時按上述色譜分析條件進行色譜分析檢測，根據得到的回歸方程計算其曲安奈德的含量，結果顯示RSD＝0.83％(n＝9)，表明釋放液在30d內穩定。

重復性實驗

取同一釋放液，分成6份，配置成6份平行樣本，按上述色譜分析條件進行色譜分析檢測，根據得到的回歸方程計算其曲安奈德的含量，結果顯示RSD＝1.01％，(n＝6)，表明該方法重復性良好。

體外釋放率

按照上述色譜分析條件，分別色譜分析體外緩釋試驗所得釋放液，算得色譜峰面積，代入得到的回歸方程，得到各樣本溶液濃度。再根據累積釋放率公式得到曲安奈德的累積釋放率，累積釋放率＝(∑CV)/M，其中C為根據回歸方程計算得到的各樣本釋放液中曲安奈德濃度，V為各樣本釋放液體積，M為溶解入生物蛋白膠內曲安奈德的質量。以累計釋放率為縱坐標(Y軸)，以時間為橫坐標(X軸)，做一如圖2所示體外累計釋放率曲線。由圖2可知，生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑可在外界環境溫度為37℃的條件下，在生理鹽水中持續穩定釋放，緩釋時長長達120h。表明曲安奈德在生物蛋白膠中的緩釋效果有良好的穩定性和時效性。

施藥方法：

將實施例四制備得到的生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑裝入內鏡配套的噴涂裝置內，內鏡管道沿內鏡活檢孔道伸入，內鏡管道外口與噴涂裝置相連，內鏡管道內口在直視下對應患者消化道指定部位，即可對指定部位噴涂生物蛋白膠-曲安奈德緩釋劑。