本發明屬于生物，具體涉及一種aco3?mrna分子在蘋果屬植物種子到果肉間傳遞的鑒定方法。

背景技術：

1、維管植物通過整合、傳遞植物器官所感知的環境信息來響應各種逆境。長距離信號傳導在植物適應嚴酷的環境條件以及逆境后的生存中起著至關重要的作用。在高等植物中，rna、蛋白質、小肽、植物激素等，可通過維管系統傳遞到靶器官，進而調控不同的生物學過程。現代rna信息傳遞的研究，主要集中在內源非編碼rna的轉錄后調控以及mrna在源庫之間(砧穗系統以及葉片到莖尖)通過維管系統長距離運輸的研究。rna分子可以通過胞間連絲通道(pd)介導的韌皮部-篩管向植物遠端組織和細胞進行長距離傳遞。

2、肉質果實的成熟與種子成熟是一個復雜的且高度協調的發育過程，果實組織軟化以吸引動物取食及種子的傳播，進而完成整個生命過程。1-氨基環丙烷-1-羧酸氧化酶(aco)是乙烯合成過程中重要的限速酶，在蘋果中已報道的aco基因有3個，分別為mdaco1、mdaco2、mdaco3，在果實成熟過程中發揮重要作用。蘋果種子果肉間具有發達的維管系統以促進水分及同化物的運輸，其中，主維管束是果實同化物運輸和卸載的重要載體，種子傳遞出來的基因，“搭載”在同化物上，通過主維管束一同泵入到果肉薄壁組織中，再通過胞間連絲進行細胞間的近距離傳遞，進而推進果實的發育成熟。與砧穗系統源-庫長距離傳遞不同的是，蘋果果實中庫器官之間的分子傳遞鑒定方法，拓寬了多年生木本植物長距離傳遞的研究范疇，同時，多元傳遞系統的疊加，也為深入探究果實發育奠定基礎。

3、目前已從擬南芥、南瓜、黃瓜、番茄、馬鈴薯、梨、蘋果等多個物種中鑒定到可以通過植物韌皮部進行長距離傳遞的內源rna分子。目前已報道的研究中，長距離傳遞信號分子的鑒定技術主要包括轉基因嫁接后檢測特異性標簽蛋白、mrna標記特異的分子探針、巢式rt-pcr、rt-pcr-caps等，雖然這些技術對于鑒定嫁接復合體中基因傳遞性比較準確，但依然存在過程繁瑣、成本高、周期長、對基因序列要求高、工作量較大等不足之處，更重要的是，這些鑒定途徑大多圍繞同源或異源嫁接系統中源-庫之間的長距離運輸，對于植物本體發育中庫器官之間的信息傳遞，內源mrna的傳遞性鑒定還應突破新的途徑和更加簡單高效的方法。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題是提供一種利用snp(單核苷酸多態性)鑒定蘋果果實本體種子到果肉的傳遞方法。所要解決的技術問題不限于所描述的技術主題，本領域技術人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術主題。

2、為解決上述技術問題，本發明提供了以下技術方案：

3、根據發育遺傳學規律，蘋果果肉為花托發育而來的肉質假果，基因型純合且與母本相同，種子的基因型則來源于父母本。

4、本發明提供了一種鑒定aco3?mrna分子在蘋果屬植物的種子到果肉間傳遞的方法，包括如下步驟：檢測待鑒定蘋果屬植物的果肉的aco3?mrna的seq?id?no.1的第1058位核苷酸的種類，根據所述核苷酸的種類鑒定或輔助鑒定aco3?mrna分子是否由種子傳遞至果肉，若待鑒定蘋果屬植物的果肉含有seq?id?no.1的第1058位核苷酸為g的aco3?mrna，所述待鑒定蘋果屬植物中aco3?mrna分子是由種子傳遞至果肉，所述待鑒定蘋果屬植物中aco3?mrna分子是由種子傳遞至果肉，若待鑒定蘋果屬植物的果肉含有seq?id?no.1的第1058位核苷酸為a的aco3?mrna不含有seq?id?no.1的第1058位核苷酸為g的aco3?mrna，所述待鑒定蘋果屬植物中aco3?mrna分子非由種子傳遞至果肉或候選為非由種子傳遞至果肉；

5、所述待鑒定蘋果屬植物是父本和母本的雜交果，所述父本花藥中僅含有seq?idno.1的第1058位核苷酸為g的aco3?mrna，所述母本花托中僅含有seq?id?no.1的第1058位核苷酸為a的aco3?mrna，所述種子中既含有seq?id?no.1的第1058位核苷酸為a的aco3mrna，也含有seq?id?no.1的第1058位核苷酸為g的aco3?mrna。

6、進一步地，上述方法中檢測待鑒定蘋果屬植物的果肉的aco3?mrna的seq?id?no.1的第1058位核苷酸的種類的方法包括以待鑒定蘋果屬植物的果肉的總rna反轉錄得到的cdna為模板，利用pcr引物進行pcr擴增得到pcr產物，對所述pcr產物進行測序，確定待鑒定蘋果屬植物的果肉的aco3?mrna的seq?id?no.1的第1058位核苷酸的種類；

7、所述pcr引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物為核苷酸序列為seq?idno.2的單鏈dna，具體序列如：5`-aaccaaacacttgttgagagagag-3`；所述反向引物為核苷酸序列為seq?id?no.3的單鏈dna，具體序列如：5`-gttacattctacaacgatttccaca-3`。

8、進一步地，上述方法中所述待鑒定蘋果屬植物的果肉的總rna是從花后s6時期的蘋果屬植物的果肉中提取的，所述花后s6時期為授粉后130天。具體而言，可在以‘紅星’蘋果花托為母本，‘蜜脆’蘋果花藥為父本的人工授粉后得到的雜交果(授粉后130天)中提取總rna。

9、進一步地，上述方法中所述待鑒定蘋果屬植物可為蘋果。具體而言，前述蘋果可為‘紅星’蘋果ב蜜脆’蘋果雜交果，且所述‘紅星’蘋果的花托為母本，所述‘蜜脆’蘋果的花藥為父本。

10、本發明還提供了核苷酸序列為seq?id?no.1的dna、或所述的引物在鑒定aco3mrna分子在蘋果屬植物的種子到果肉間傳遞中的應用。

11、本發明通過設計特異性引物，分離克隆得到各自的aco3?mrna序列，通過一代測序分析比對，比較親本和子一代種子和果肉序列中snp來源，最終利用snp(單核苷酸多態性)鑒定蘋果果實本體種子到果肉的傳遞方法，該方法具有準確性高、方便快捷、成本低等特點。可用于解決蘋果果實發育過程中庫器官之間長距離傳遞mrna分子的鑒定，更可用于多年生木本植物長距離傳遞的研究，或可以作為一種通用的工具，用于精準的分子設計，指導育種計劃，同時，為育種工作者創制抗病性強、適應性好、成本低、品質優的新品種提供了有效的新途徑。

技術特征：

1.一種鑒定aco3?mrna分子在蘋果屬植物的種子到果肉間傳遞的方法，其特征在于，包括如下步驟：檢測待鑒定蘋果屬植物的果肉的aco3?mrna的seq?id?no.1的第1058位核苷酸的種類，根據所述核苷酸的種類鑒定或輔助鑒定aco3?mrna分子是否由種子傳遞至果肉，若待鑒定蘋果屬植物的果肉含有seq?id?no.1的第1058位核苷酸為g的aco3?mrna，所述待鑒定蘋果屬植物中aco3?mrna分子是由種子傳遞至果肉；

2.根據權利要求1的方法，檢測待鑒定蘋果屬植物的果肉的aco3?mrna的seq?id?no.1的第1058位核苷酸的種類的方法包括以待鑒定蘋果屬植物的果肉的總rna反轉錄得到的cdna為模板，利用pcr引物進行pcr擴增得到pcr產物，對所述pcr產物進行測序，確定待鑒定蘋果屬植物的果肉的aco3?mrna的seq?id?no.1的第1058位核苷酸的種類；

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待鑒定蘋果屬植物的果肉的總rna是從花后s6時期的蘋果屬植物的果肉中提取的，所述花后s6時期為授粉后130天。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述待鑒定蘋果屬植物可為蘋果。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述蘋果可為‘紅星’蘋果ב蜜脆’蘋果雜交果。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述‘紅星’蘋果ב蜜脆’蘋果的雜交組合中，所述‘紅星’蘋果的花托為母本，所述‘蜜脆’蘋果的花藥為父本。

7.核苷酸序列為seq?id?no.1的dna、或權利要求2中所述的引物在鑒定aco3mrna分子在蘋果屬植物的種子到果肉間傳遞中的應用。

技術總結
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種ACO3mRNA分子在蘋果屬植物種子到果肉間傳遞的鑒定方法，本發明提供的方法可以準確、高效、便捷、經濟實惠地鑒定蘋果果實本體中，mRNA分子從種子到果肉能否進行傳遞。揭示庫器官之間信號傳遞的有效鑒定手段，為果樹育種提供新思路。本發明提供的方法基于發育遺傳學規律，準確性高，便捷，具有重大的應用價值。

技術研發人員：吳婷,王婷,許琛,黎眉鑠,郝心怡,儲子程,韓振海,張新忠,王憶,許雪峰
受保護的技術使用者：中國農業大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28