本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一株高產(chǎn)己二酸菌株及其篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、己二酸(adipic?acid，adipate)又稱(chēng)肥酸，是一種重要的有機(jī)二元酸，廣泛應(yīng)用于化工生產(chǎn)、有機(jī)合成工業(yè)、醫(yī)藥、潤(rùn)滑劑制造等方面。

2、目前己二酸的主要生產(chǎn)方式是化學(xué)合成，但是該方法的產(chǎn)品收率并不高。此外，在己二酸的化學(xué)合成過(guò)程中主要以苯為原料，通過(guò)化學(xué)方法合成，原料和中間產(chǎn)物毒性很強(qiáng)，而且過(guò)程中產(chǎn)生大量的n2o等溫室氣體，環(huán)境污染嚴(yán)重且不可持續(xù)。

3、為了解決上述問(wèn)題，人們將目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基礎(chǔ)工作。目前報(bào)道的主要生物合成己二酸的方法有生物催化法和全生物合成方法。主要的生物催化法主要是利用微生物催化合成己二酸前體順，順-粘康酸，然后再利用金屬催化劑催化合成己二酸。全生物合成己二酸的方法包括：大腸桿菌以葡萄糖為底物利用乙酰coa和琥珀酰coa作為底物全生物合成；釀酒酵母利用脂肪酸氧化法全生物合成己二酸。以葡萄糖為底物全生物合成己二酸具有工藝流程簡(jiǎn)單、總投入成本低、可循環(huán)利用等突出優(yōu)點(diǎn)，因此備受研究人員青睞。但是上述反應(yīng)在生產(chǎn)己二酸的過(guò)程中，己二酸產(chǎn)量均無(wú)法突破60g/l，嚴(yán)重限制了生物產(chǎn)己二酸的工業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，為了解決上述技術(shù)問(wèn)題之一，本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)己二酸菌株及其篩選方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述的突變菌株可連續(xù)化生產(chǎn)己二酸，且己二酸產(chǎn)量高達(dá)78g/l、生產(chǎn)成本較低，為生物合成己二酸工業(yè)化的精準(zhǔn)應(yīng)用奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)己二酸菌株tb131。

4、本發(fā)明是以導(dǎo)入了己二酸合成途徑的工程大腸桿菌mg1655為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變處理后篩選得到的。與出發(fā)菌株比較，該突變株tb131的己二酸產(chǎn)量達(dá)到了78g/l，且傳代十代內(nèi)的遺傳性狀穩(wěn)定。

5、本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物中含有所述菌株tb131。

6、在一種實(shí)施方式中，所述組合物為固態(tài)或液態(tài)菌劑。

7、在一種實(shí)施方式中，所述組合物含有菌濃≥1×105cfu/g或菌濃≥1×105cfu/ml的菌株tb131。

8、本發(fā)明還提供了一種制備己二酸的方法，所述方法為將所述菌株tb131或所述組合物接種于反應(yīng)體系中進(jìn)行己二酸的發(fā)酵制備。

9、在一種實(shí)施方式中，所述反應(yīng)體系包括葡萄糖8g/l、酵母粉5g/l、胰蛋白胨20g/l、六水合氯化鎂2.03g/l、氯化鈉0.5g/l、氯化鉀0.186g/l。

10、本發(fā)明還提供了所述的菌株tb131或所述組合物在生產(chǎn)己二酸中的應(yīng)用。

11、在某一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了一種突變菌株的選育方法，所述選育方法是進(jìn)行artp誘變，通過(guò)初篩以及復(fù)篩和驗(yàn)證、選育出一株高產(chǎn)己二酸且遺傳穩(wěn)定的突變菌株。

12、本發(fā)明所述選育方法包括以下步驟：

13、(1)菌懸液的制備：將出發(fā)菌株接入種子培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取出菌懸液，使用0.9％?nacl溶液對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊渚簅d600在0.60.7；得到誘變菌懸液；

14、(2)artp誘變；

15、(3)初篩：挑取大的、圓形的、表面光滑的單菌落進(jìn)行活化、發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)己二酸，通過(guò)與出發(fā)菌株比較己二酸產(chǎn)量的高低進(jìn)行篩選。

16、(4)復(fù)篩：挑選己二酸產(chǎn)量最高且傳代較為穩(wěn)定的突變菌株并對(duì)菌株穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。

17、作為優(yōu)選的，所述artp誘變時(shí)間為75s。

18、本發(fā)明所述選育方法的具體步驟為：

19、(1)artp誘變處理：

20、將出發(fā)菌株從固體培養(yǎng)基上挑取一環(huán)菌接入裝有50ml種子液的250ml錐形瓶接種，于37℃、250r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取出錐形瓶中的菌懸液，使用0.9％的nacl溶液對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋得到誘變菌懸液，使其菌液od600在0.6?0.7。吸取誘變菌懸液與5％(v/v)甘油按1:1的比例混合的菌懸液20μl均勻涂抹于金屬載片上，置于artp誘變儀中，設(shè)定功率為120w、通氣量為10slm，處理時(shí)間為75s，將處理過(guò)的金屬墊片放入裝有980μl無(wú)菌水的ep管中，充分震蕩后按十倍梯度稀釋?zhuān)∵m宜梯度稀釋液100μl涂布于固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d。

21、(2)誘變菌株的篩選

22、a.初篩：將誘變后的菌落進(jìn)行初篩處理，挑取大的、圓形的、表面光滑的單菌落接入種子液中，于37℃、250r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，按接種量為2％，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子液接入50ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、250r/min條件下恒溫培養(yǎng)72h獲得發(fā)酵液；將發(fā)酵液十倍體積稀釋?zhuān)褂酶咝б合嗌V儀檢測(cè)己二酸產(chǎn)量。

23、b.復(fù)篩：將初篩后己二酸產(chǎn)量發(fā)生顯著變化突變菌株進(jìn)行活化、發(fā)酵，收集不同菌株發(fā)酵液樣品，進(jìn)行復(fù)篩；挑選己二酸產(chǎn)量最高且傳代較為穩(wěn)定的突變菌株。

24、(3)優(yōu)良突變菌株產(chǎn)量穩(wěn)定性的測(cè)定

25、將優(yōu)良突變菌株從固體平板挑出后接種至固體培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)1d，記為1代，同樣條件下，固體培養(yǎng)基平板傳代培養(yǎng)至10代；將1～10代優(yōu)良突變菌株按驟(2)中所述誘變菌株的初篩和復(fù)篩方法進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定。

26、本發(fā)明通過(guò)artp誘變提高了突變效率，誘變目的性強(qiáng)、實(shí)用性高。本發(fā)明優(yōu)化后的誘變條件為：artp誘變時(shí)間為75s。經(jīng)過(guò)artp誘變，其誘變致死率≥90％。在此條件下，更容易獲得高產(chǎn)己二酸的誘變菌株。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

28、本發(fā)明利用常壓室溫等離子體誘變技術(shù)(artp)對(duì)含有己二酸合成途徑的工程大腸桿菌進(jìn)行誘變，獲得了一株高產(chǎn)己二酸的突變菌株tb131。與出發(fā)菌株比較，該菌株生產(chǎn)的己二酸產(chǎn)量提高到了78g/l，且該突變體具有穩(wěn)定的遺傳性能。所生產(chǎn)的己二酸可用于制備潤(rùn)滑劑、化工生產(chǎn)或合成醫(yī)藥。因此，本發(fā)明為生物法工業(yè)化生產(chǎn)己二酸及其應(yīng)用奠定了重要的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一株高產(chǎn)己二酸菌株tb131，其特征在于，所述菌株由含有己二酸生產(chǎn)途徑的工程大腸桿菌誘變得到。

2.一種組合物，其特征在于，所述組合物中含有權(quán)利要求1所述菌株tb131。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述組合物為固態(tài)或液態(tài)菌劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的組合，其特征在于，所述組合物含有菌濃≥1×105cfu/g或菌濃≥1×105cfu/ml的菌株tb131。

5.一種制備己二酸的方法，其特征在于，所述方法為將權(quán)利要求1所述菌株tb131或權(quán)利要求2～4任一所述組合物接種于反應(yīng)體系中進(jìn)行己二酸的發(fā)酵制備。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系包括葡萄糖8g/l、酵母粉5g/l、胰蛋白胨20g/l、六水合氯化鎂2.03g/l、氯化鈉0.5g/l、氯化鉀0.186g/l。

7.一株高產(chǎn)己二酸菌株的篩選方法，其特征在于，以含有己二酸生產(chǎn)途徑的工程大腸桿菌為出發(fā)菌株，將其菌懸液進(jìn)行artp誘變，篩選高產(chǎn)己二酸的突變菌株。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法包括以下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的篩選方法，其特征在于，所述artp誘變的時(shí)間為75s。

10.權(quán)利要求1所述的菌株tb131或權(quán)利要求2～4任一所述組合物在生產(chǎn)己二酸中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一株高產(chǎn)己二酸菌株及其篩選方法與應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以導(dǎo)入了己二酸合成途徑的工程大腸桿菌MG1655為出發(fā)菌株，利用ARTP誘變技術(shù)誘變及篩選出一株能夠穩(wěn)定高產(chǎn)己二酸的菌株，命名為T(mén)B131。將誘變篩選得到的突變株TB131置于含有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)己二酸，己二酸產(chǎn)量為3.41g/L，產(chǎn)率為0.43。后將突變株TB131置于5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖可使己二酸產(chǎn)量達(dá)到78g/L，為后續(xù)己二酸研究及生物產(chǎn)己二酸的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧禹,李國(guó)輝,毛銀,趙運(yùn)英,周勝虎
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28