本發明涉及基因工程，尤其涉及一種針對rna剪接表型的高通量篩選方法。

背景技術：

1、真核生物中，pre-mrna的剪接是后轉錄過程中的最為關鍵的調控步驟之一。這個過程是指由剪接體識別外顯子與內含子的邊界、剪接位點以及位于內含子3'端的剪接位點多聚嘧啶序列上游18-40個核苷酸的短序列分支點，將轉錄后的pre-mrna去除內含子，保留外顯子并形成mrna。在高效轉錄加工過程中，還需要特定的序列來招募不同的反式作用調控因子，這些反式作用調控因子將作為剪接體和剪接位點選擇的調節因子發揮重要的功能。

2、40年前研究人員發現膜結合抗體和分泌抗體由同一基因編碼，首次報道了pre-mrna的選擇性剪接，基因編碼的蛋白質數目通過選擇性剪接實現了翻倍。盡管人們曾一度認為這是不合常理的，但是隨著科學研究的發展，pre-mrna的選擇性剪接而編碼多個蛋白質(或蛋白質亞型)的報道層出不窮。研究者們發現，大多數人類基因都會發生選擇性剪接，產生包含不同外顯子組合的多個剪接異構體，rna的選擇性剪接大大增加了高等真核生物的基因組復雜性。同時，rna剪接具有組織特異性。近年來的研究中發現一種普遍存在的現象，那就是選擇性剪接的類型在組織間存在差異。例如，在肝臟中，一些選擇性的3'端剪接位點和選擇性5'端剪接位點的剪接頻率比在其他組織中高約50-100％。

3、越來越多人類疾病的基礎與rna錯誤剪接相關。正如前面所說，rna剪接是由復雜的調節機制調控的，包括許多rna結合蛋白與它們之間的相互作用網絡。一般來說，如果剪接發生錯誤就會導致剪接疾病。因此，剪接順式作用元件，剪接體或調控蛋白的突變都可能會影響剪接或選擇性剪接的準確性。在幾項研究中證明了pre-mrna剪接的變化是一種常見的致病機制。例如，運動神經元存活相關基因smn2第7外顯子上的點突變導致剪接時大部分轉錄本的第7外顯子跳過以及翻譯后蛋白變短，導致運動神經元存活蛋白缺失和運動神經元退行性疾病，引發脊髓性肌萎縮癥；核纖層蛋白a基因lmna第11外顯子的點突變導致剪接時外顯子11的后150bp跳過，從而導致蛋白翻譯提前終止，形成早老素，引發哈欽森-吉爾福德早衰癥；囊性纖維化是一種常染色體隱性遺傳疾病，由囊性纖維化跨膜傳導調節因子基因cftr突變引起，位于3849+10kb的c>t是cf中最常見的剪接突變，導致剪接時包含一個帶有提前終止密碼子的偽外顯子，該基因突變降低了編碼蛋白的氯通道活性。隨著科學研究的深入，對剪接疾病的系統研究具有重大意義。

4、結合crispr干擾(crispri)技術的篩選方法是系統性研究人類rna剪接表型的有力手段。crispr序列是原核生物基因組內的一段重復序列，是生命進化歷史上，細菌和病毒之間產生的免疫工具。病毒侵染細菌后能夠將基因整合到細菌基因組上，利用細菌的細胞工具協助病毒基因復制。細菌進化出crispr-cas9系統，把病毒基因從自己的基因組上切除，這是細菌特有的免疫系統，是細菌抵抗病毒等外源遺傳物質入侵的一種獲得性免疫系統。該系統包括編碼脫氧核糖核酸酶cas9蛋白的基因和兩個rna，一個成熟的crispr?rna(crrna)和一個部分互補的反式作用crisprrna(tracrrna)，這兩個rna引導cas9蛋白破壞外源dna。細菌的這種免疫系統區分自我與非自我的機制在于所識別的靶dna結合位點包含一個與dna互補區并列的原間隔鄰基序(pam序列ngg)，間隔序列來自于外來入侵dna，因此不會誘導自身免疫。這種利用rna引導脫氧核糖核酸酶cas9的基因工程方法，已被應用于哺乳動物細胞。科學家對此系統的利用過程中發現，通過使用工程化的小向導rna(sgrna)可以簡化這一過程，sgrna包含一個仿tracrrna-crrna復合物的發夾和與靶dna互補的短序列。cas9核酸內切酶可以產生與sgrna結合的靶dna的序列特異性雙鏈斷裂，隨后通過非同源末端連接途徑修復，這個過程經常導致小片段缺失或插入，從而破壞基因功能。因此，crispr?rna引導的cas9核酸酶系統只需要兩個分子：cas9蛋白和用于靶向基因的sgrna，不需要蛋白質或表達質粒的構建，使用sgrna進行基因編輯使crispr系統具有強大優勢。由于cas9會造成dna雙鏈斷裂，具有一定細胞毒性并且不可逆轉，研究人員通過使用sgrna引導失活的cas9(dcas9)，結合到靶標基因轉錄起始位點來抑制基因的轉錄，dcas9沒有核酸酶活性，但是由于其上方結合的krab轉錄抑制結構域依舊能夠起到抑制基因的轉錄的作用,稱之為crispr干擾(crispri)。

5、研究人員曾利用crispr系統在神經元中進行了全基因組范圍內的大規模篩選，揭示了在自閉癥中被破壞的神經元微外顯子的剪接調節機制。在另一項研究中為了確定參與rna加工的哪些因子在前列腺癌中是必需的，進行了全基因組crispr/cas9敲除篩選，揭示了hnrnpl及其靶標rna在前列腺癌生長中發揮的作用。自從sanger測序技術普及以來，二代測序(next-generation?sequencing，ngs)技術具有顯著的發展，能夠進行單分子水平dna測序和輸出更海量且全面的數據，具有更高的測序效率和更為廣泛的應用能力。例如illumina測序方法，是一種短讀長測序(short-read?sequencing)技術，對經過擴增的短片段dna分子進行大規模測序。ngs流程包括文庫制備、方法測序和數據分析三部分。二代測序技術在幾項大規模篩選研究中對測序的高通量需求都起到了至關重要的作用。研究人員首次在人類神經元中進行了全基因組crispr篩選，揭示了與神經退行性疾病相關的控制神經對慢性氧化應激反應的通路，將溶酶體衰竭與鐵死亡聯系起來。在另一項研究中，利用crispr系統在神經元中進行全基因組的大規模篩選，揭示在自閉癥中被破壞的神經元微外顯子剪接調節機制。

6、真核生物中，pre-mrna的剪接是后轉錄過程中的最為關鍵的調控步驟之一，研究表明越來越多人類疾病的基礎與rna錯誤剪接相關。然而絕大多數剪接事件的調控因子尚不明確，雖然已經有一些報道提供了利用crispr系統針對某一剪接疾病進行大規模遺傳篩選以篩查調控因子的方法，然而在以往的這些研究中，大多需要借助熒光蛋白信號將目標細胞群分選出來，用熒光信號指示剪接信息相對來說是一種間接手段，將剪接信息轉換成蛋白信號，而蛋白信號可能帶來噪點，并且其中能夠將篩選方法應用到多數剪接疾病的篩選方法仍然很缺乏。在不借助借助熒光蛋白信號的條件下，目前尚無能夠廣泛針對rna剪接表型的高通量篩選方法的系統性研究。

7、因此，現有技術仍有待于改進和發展。

技術實現思路

1、鑒于上述現有技術的不足，本發明提供了一種針對rna剪接表型的高通量篩選方法，旨在解決在不采用熒光信號指示剪接信息的情況下，如何針對各種剪接疾病進行大規模遺傳篩選以篩查剪接事件調控因子的問題。

2、具體地，本發明的技術方案如下：

3、本發明提供一種針對rna剪接表型的高通量篩選方法，包括步驟：

4、s1、設計引物對，對dna模板進行pcr擴增，構建報告基因，通過同源重組將所述報告基因克隆到載體中，構建報告基因載體；

5、s2、酶切所述報告基因載體和sgrna文庫基因后，連接構建報告基因-sgrna質粒文庫；

6、s3、將所述報告基因-sgrna質粒文庫轉入hek293t-crispri細胞系基因組，篩純并收集mrna；

7、s4、構建報告基因-sgrnamrna文庫，通過二代測序技術檢測所述報告基因mrna的剪接形式，篩選出調控所述報告基因剪接的sgrna靶向基因。

8、所述的針對rna剪接表型的高通量篩選方法，其中，所述載體為慢病毒載體。

9、可選地，所述報告基因載體包括順序連接的ef1α啟動子、報告基因、u6啟動子、sgrna文庫基因。

10、所述的的針對rna剪接表型的高通量篩選方法，其中，所述報告基因為smn2報告基因，所述smn2報告基因包括smn2基因外顯子6的111bp基因片段以及其后內含子的200bp基因片段、smn2基因外顯子7的54bp基因片段及其前內含子的261bp基因片段和其后內含子的444bp基因片段以及smn2基因外顯子8的574bp基因片段。

11、可選地，所述smn2報告基因的序列為seq?id?no.1所示的核苷酸序列。

12、可選地，所述報告基因為smn2報告基因時，所述引物對為：

13、1f:ggggcacaagcttaattaagaattcataattcccccacctcccatatgtccag，

14、1r:gtggtgtcatttagtgctgctctatgccagcatttcctgcaaatga；或

15、2f:gaaatgctggcatagagcagcactaaatgacaccac，

16、2r:gtaagtcattggtcttaaagtcgactttaaaaaaaaattaaatatttttattatatact。

17、所述的針對rna剪接表型的高通量篩選方法，其中，所述報告基因為xbp1報告基因，所述xbp1報告基因包括xbp1基因第4451-4476位的26bp剪接部位、所述剪接部位前的106bp基因片段和所述剪接部位后的32bp基因片段。

18、可選地，所述xbp1報告基因的序列為seq?id?no.2所示的核苷酸序列。

19、可選地，所述報告基因為xbp1報告基因時，所述引物對為：

20、xbp1-f：taagaattcggagttaagacagcgcttgg，

21、xbp1-r：aagtcgactgttctggaggggtgacaac。

22、所述的的針對rna剪接表型的高通量篩選方法，其中，所述hek293t-crispri細胞系包括crispri系統，所述crispri系統敲低所述sgrna靶向基因。

23、可選地，所述crispri系統中cas核酸酶為dcas9核酸酶。

24、本發明具有以下有益效果：

25、本發明提供一種針對rna剪接表型的高通量篩選方法，通過構建報告基因-sgrna質粒文庫，利用hek293t-crispri細胞系中的crispri系統進行高通量篩選，使得報告基因的剪接信息與sgrna信息能夠被記錄在同一條mrna上，再通過二代測序檢測報告基因mrna的剪接形式是否發生改變來確定所敲低的靶向基因對報告基因剪接的影響，從而確定調控剪接事件的靶向基因。該方法也避免了通過將剪接信息轉換成蛋白信號來確定剪接形式而帶來的噪點，因而檢測靈敏度高，分辨率高。本發明的針對rna剪接表型的高通量篩選方法具有廣泛應用到各類剪接事件的遺傳篩選中的能力，成為研究rna剪接的有力工具，對各類剪接事件進行系統研究具有重大意義。