本發明涉及不結球白菜育種，具體涉及到一種與不結球白菜香氣性狀石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記及其引物和應用。

背景技術：

1、不結球白菜是我國常見的綠葉蔬菜，其在中國的栽培歷史悠久，具有豐富的種質資源，在我國廣泛栽培。隨著人們生活水平的日益提高，對于蔬菜的外觀和品質要求也在不斷的提升，特殊風味的不結球白菜具有一定的市場價值和營養價值。

2、香氣性狀是目前不結球白菜育種的重要性狀之一，香氣主要受各類揮發物的影響，石竹烯是不結球白菜品種香青菜中特殊的揮發性倍半萜類物質。傳統的育種和品種鑒定方式存在費時、費力等各種因素的影響，隨著測序技術和分子生物學技術的發展，基于分子標記輔助選擇的育種技術逐步發展起來，通過石竹烯有無和分子標記的緊密連鎖特征，可在種子期間通過檢測連鎖的分子標記判斷不結球白菜的是否含有石竹烯，加快不結球白菜石竹烯性狀育種進度，縮短育種年限，也可以作為市場不結球白菜不同品種香氣性狀鑒定的方法之一。

技術實現思路

1、本發明提供了一種檢測不結球白菜石竹烯相關的kasp分子標記及其引物和應用，其主要目的在于提供一種分子標記，降低對大量樣本石竹烯是否存在分子標記輔助選擇的成本，提高育種效率。

2、本發明技術方案如下：

3、本發明的第一個目的是提供與不結球白菜中石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記，所述分子標記定位于不結球白菜第6號染色體上，命名為ynβc，所述ynβc的核苷酸序列如seqid?no.1所示：

4、tctctgccccaaacatttcttggttcaagtgtcgcctctcaccatttcagttttgttttcattaaaaaatcatttttattagttataacaaactgtttatttccaatttccttcctatatgagtgcttcacgtatctataacagagaattgaaggcattttttctttccatagttttttatttacagagattgttcaataaaattttatatacttttcagttggttaattatttttagagtataattagttttttttaattatttctccattacatttgtgtgtttacattattttggttg，其中，在第151bp處發生g→t的突變，堿基t為不含有石竹烯的不結球白菜材料所特有。

5、本發明的第二個目的是提供用于檢測前述與不結球白菜中石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記的引物對。

6、進一步的，所述引物對包括含有石竹烯的不結球白菜等位型上游引物ynβc-f、不含石竹烯的不結球白菜等位型上游引物ynβc-h、和共用下游引物ynβc-c，

7、在某個特殊的實施例中，含有石竹烯的不結球白菜品種為香青菜；

8、在某個特殊的實施例中，不含有石竹烯的不結球白菜品種為蘇州青；

9、ynβc-f序列如seq?id?no.2所示：

10、5’-fam-gaaggtgaccaagttcatgctgcttcacgtatctataacagagaattg-3’；

11、ynβc-h序列如seq?id?no.3所示：

12、5’-hex-gaaggtcggagtcaacggattgcttcacgtatctataacagagaattt-3’；

13、ynβc-c序列如seq?id?no.4所示：

14、5’-aaaactatggaaagaaaaaatgcct-3’。

15、所述ynβc-f的5'端為fam熒光信號標簽，fam標簽序列為：5'-fam-gaaggtgaccaagttcatgct-3'；

16、所述ynβc-h的5'端為hex熒光信號標簽，hex熒光信號標簽序列為5'-hex-gaaggtcggagtcaacggatt-3'。

17、本發明的第三個目的是提供包括前述引物對的試劑盒。

18、本發明的第四個目的是提供一種鑒定不結球白菜中是否含有石竹烯的方法，所述方法包括以下步驟：

19、(1)提取待測不結球白菜的基因組總dna；

20、(2)采用前述引物對對待測的不結球白菜的基因組總dna進行pcr擴增；

21、(3)對擴增產物進行基因分型檢測，根據基因分型的結果判斷樣本材料中是否具有石竹烯。

22、進一步的，步驟(2)所述pcr擴增的反應體系為：pcr擴增的總體系為10μl，包括2×kasp?master?mix?5μl，kasp?primer?mix?0.14μl，模板dna?1.0μl，ddh2o?3.86μl；

23、pcr擴增反應程序如下：95℃預變性15min；95℃變性20s；61-55℃退火延伸60s，10個循環，每個循環降低0.6℃；95℃變性20s；55℃退火延伸60s，26個循環。

24、進一步的，步驟(3)所述基因分型的方法為，根據熒光信號的類型判斷分子標記的基因型，進而判斷樣本材料中是否具有石竹烯；

25、當待測不結球白菜包括基于ynβc-h擴增得到的連接hex熒光標簽序列的等位基因型，則所述待測不結球白菜不含石竹烯；

26、當待測不結球白菜包括基于ynβc-f擴增得到的連接fam熒光標簽序列的等位基因型或為雜合型，則所述待測不結球白菜含有石竹烯。

27、進一步的，步驟(3)所述基因分型的方法為：pcr擴增反應結束后，采用酶標儀檢測pcr產物，將數據導入klustercaller數據處理軟件進行分析，進行聚類分析，聚合在接近x軸的樣本的基因型為基于ynβc-f擴增得到的連接fam熒光標簽序列的等位基因型，聚合在接近y軸上的樣本的基因型為基于ynβc-h擴增得到的連接hex熒光標簽序列的等位基因型，中間的樣本的基因型為雜合型。

28、本發明的第五個目的時提供前述與不結球白菜中石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記或前述的引物對或前述的試劑盒在鑒定不結球白菜中是否含有石竹烯中的應用。

29、本發明的第六個目的是提供前述與不結球白菜中石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記或前述的引物對或前述的試劑盒在不結球白菜分子標記輔助育種中的應用。

30、本發明有益效果在于：

31、本發提供了一個能夠精準鑒定不結球白菜石竹烯有無相關的kasp分子標記，其可以用于不結球白菜風味相關分子育種和種質資源分析。本發明開發獲得的分子標記，用于檢測不結球白菜中石竹烯的有無，根據該發明提供的bcβc-kasp標記進行基因分型，在pcr擴增后不用酶切和電泳，可以高通量檢測多個樣品，大大提高了檢測效率。可用于大量不結球白菜品種在種子階段進行石竹烯有無的預測，相較于常規育種，育種的時間越短，鑒定更加準確。

技術特征：

1.與不結球白菜中香氣性狀石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記，其特征在于，所述分子標記定位于不結球白菜第6號染色體上，命名為ynβc，所述ynβc的核苷酸序列如seq?idno.1所示：

2.用于檢測權利要求1所述與不結球白菜中香氣性狀石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記的引物對。

3.根據權利要求2所述的引物對，其特征在于，所述引物對包括含有石竹烯的不結球白菜等位型上游引物ynβc-f、不含石竹烯的不結球白菜等位型上游引物ynβc-h、和共用下游引物ynβc-c，

4.包括權利要求2或3所述引物對的試劑盒。

5.一種鑒定不結球白菜中是否含有石竹烯的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述pcr擴增的反應體系為：pcr擴增的總體系為10μl，包括2×kasp?master?mix?5μl，kasp?primer?mix?0.14μl，模板dna1.0μl，ddh2o?3.86μl；

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述基因分型的方法為，根據熒光信號的類型判斷分子標記的基因型，進而判斷樣本材料中是否具有石竹烯；

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述基因分型的方法為：pcr擴增反應結束后，采用酶標儀檢測pcr產物，將數據導入klustercaller數據處理軟件進行分析，進行聚類分析，聚合在接近x軸的樣本的基因型為基于ynβc-f擴增得到的連接fam熒光標簽序列的等位基因型，聚合在接近y軸上的樣本的基因型為基于ynβc-h擴增得到的連接hex熒光標簽序列的等位基因型，中間的樣本的基因型為雜合型。

9.權利要求1所述與不結球白菜中石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記或權利要求2所述的引物對或權利要求4所述的試劑盒或權利要求5至8中任意一項所述的方法在鑒定不結球白菜中是否含有石竹烯中的應用。

10.權利要求1所述與不結球白菜中石竹烯緊密連鎖的kasp分子標記或權利要求2所述的引物對或權利要求4所述的試劑盒或權利要求5至8中任意一項所述的方法在不結球白菜分子標記輔助育種中的應用。

技術總結
本發明公開了一種檢測與不結球白菜香氣性狀石竹烯緊密相關的KASP分子標記及其方法，所述分子標記是根據石竹烯含量及F2遺傳群體設計的,SNP位點為A06染色體A06?37805032，命名為YNβc，所述YNβc的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述KASP標記引物包括兩條正向特異性引物和一條反向通用引物。根據本發明提供的KASP標記進行基因分型，在PCR擴增后不用酶切和電泳，可以高通量檢測多個樣品，快速檢測Bcβc等位基因在不結球白菜分離群體中的分布情況，結果準確性好，與常規分子標記相比具有更快捷，簡便和成本較低等優點。本發明對不結球白菜石竹烯分子標記輔助選擇育種有重要意義。

技術研發人員：李英,華玲玲,王海賓,王建軍,侯喜林
受保護的技術使用者：南京農業大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28