本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種生產(chǎn)單磷酰類脂a的重組大腸桿菌。

背景技術(shù)：

1、類脂a可以被宿主細(xì)胞表面的toll樣受體4(tlr4)識(shí)別，繼而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)，產(chǎn)生il-6、il-8、tnf-α等多種炎性因子。細(xì)胞因子的種類和數(shù)量主要取決于類脂a的結(jié)構(gòu)。其中，類脂a的衍生物單磷酰類脂a已被開發(fā)作為疫苗佐劑，可以非特異性的增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)提高疫苗效率。目前，3-o-去酰基-4’-單磷酰基脂質(zhì)a(mpl)是由葛蘭素史克公司商業(yè)化生產(chǎn)，主要是從沙門氏菌中發(fā)酵提取。然而，沙門氏菌是條件致病菌且合成多種不同結(jié)構(gòu)類脂a，操作起來(lái)比較困難，成本高。

2、大腸桿菌w3110是非致病菌，其脂多糖(lipopolysaccharide，lps)的kdo2-類脂a部分結(jié)構(gòu)單一，包含兩個(gè)2-酮-3-脫氧辛酸、六條脂肪酸鏈和c1、c4’位兩個(gè)磷酸基團(tuán)，合成途徑非常保守，因此大腸桿菌w3110是優(yōu)于沙門氏菌的類脂a工業(yè)生產(chǎn)出發(fā)菌株。類脂a自細(xì)胞內(nèi)膜內(nèi)側(cè)開始合成，合成途徑比較保守，但在轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜外側(cè)的過程中可以發(fā)生多種修飾，以適應(yīng)外界環(huán)境。目前，與類脂結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)的基因已有報(bào)道。利用這些基因，根據(jù)類脂a分子的合成及修飾機(jī)理，通過基因工程技術(shù)將大腸桿菌中類脂的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，有望成為理想的單磷酰類脂a生產(chǎn)菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為解決現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)單磷酰類脂a的方法具有致病風(fēng)險(xiǎn)、產(chǎn)物成分復(fù)雜難以分離目標(biāo)產(chǎn)物、成本高的問題，提供一種生產(chǎn)單磷酰類脂a的重組大腸桿菌，利用所述重組大腸桿菌進(jìn)行單磷酰類脂a生產(chǎn)時(shí)不涉及致病菌、產(chǎn)物單一，能進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題：

3、本發(fā)明第一方面提供一種生產(chǎn)單磷酰類脂a的重組大腸桿菌(escherichiacoli)，所述重組大腸桿菌的底盤菌的編碼類脂a合成途徑的酶的基因被替換為外源的編碼類脂a合成途徑的酶的基因，并包含外源的編碼pagl和外源的編碼lpxe的基因。

4、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述底盤菌為大腸桿菌w3110或mg1655。

5、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述編碼pagl的基因來(lái)源于沙門氏菌屬(salmonellasp.)。

6、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述編碼lpxe的基因來(lái)源于弗朗西斯菌屬(francisellasp.)。

7、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述重組大腸桿菌的編碼類脂a合成途徑的酶的基因選自以下一種或多種基因：lpxa、lpxc、lpxd、lpxb、lpxh、lpxk、lpxl、pagp和lpxm。

8、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述外源的編碼類脂a合成途徑的酶的基因?yàn)橐韵乱环N或多種：lpxa、lpxc、lpxd、lpxb、lpxh、lpxk、lpxl、pagp和lpxm；優(yōu)選為來(lái)源于沙門氏菌屬的編碼類脂a合成途徑的酶的基因。

9、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述底盤菌的laci基因被失效。

10、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述重組大腸桿菌不具有卡那霉素抗性。

11、本發(fā)明第二方面提供一種制備如第一方面所述的重組大腸桿菌(escherichiacoli)的方法，所述方法包括以下步驟：將所述重組大腸桿菌的底盤菌的編碼類脂a合成途徑的酶的基因替換為外源的編碼類脂a合成途徑的酶的基因；并導(dǎo)入外源的編碼pagl的基因和外源的編碼lpxe的基因。

12、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述重組大腸桿菌的底盤菌的編碼類脂a合成途徑的酶的基因?yàn)檫x自以下的一種或多種：lpxa、lpxc、lpxd、lpxb、lpxh、lpxk、lpxl、pagp和lpxm。

13、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述外源的編碼類脂a合成途徑的酶的基因?yàn)橐韵乱环N或多種：lpxa、lpxc、lpxd、lpxb、lpxh、lpxk、lpxl、pagp和lpxm；優(yōu)選為來(lái)源于沙門氏菌屬(salmonella?sp.)的編碼類脂a合成途徑的酶的基因。

14、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述底盤菌的laci基因被失效。

15、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述底盤菌為大腸桿菌w3110或mg1655。

16、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述編碼pagl的基因來(lái)源于沙門氏菌屬。

17、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述編碼lpxe的基因來(lái)源于弗朗西斯菌屬(francisellasp.)。

18、本發(fā)明第三方面提供一種制備單磷酰類脂a的方法，所述方法包括：

19、(1)將如第一方面所述的重組大腸桿菌(escherichia?coli)在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

20、(2)收集經(jīng)(1)所得的菌體，進(jìn)行脂多糖水解和純化。

21、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，(1)中，所述的培養(yǎng)的溫度為25-37℃，和/或所述重組大腸桿菌的接種量為0.2％，和/或所述培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基。

22、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，(2)中所述脂多糖水解包括使用有機(jī)溶劑進(jìn)行脂多糖分離的步驟，所述有機(jī)溶劑選自其中一種或多種：乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、氯仿和石油醚；

23、和/或，所述脂多糖水解包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟：超聲波浴、加入裂解液和沸水浴；

24、和/或，所述純化的步驟包括萃取和/或離心。

25、本發(fā)明第四方面提供一種如第一方面所述的重組大腸桿菌在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。

26、本發(fā)明一些實(shí)施方案中，所述疫苗佐劑中包含單磷酰類脂a。

27、在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

28、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

29、本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

30、本發(fā)明提供的重組大腸桿菌可用于生產(chǎn)單磷酰類脂a，無(wú)致病性風(fēng)險(xiǎn)，且菌株自身無(wú)抗生素篩選標(biāo)記，利于安全的、綠色的、大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。此外，本發(fā)明的重組大腸桿菌也可以作為底盤菌株進(jìn)行類脂a結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步改造。

技術(shù)特征：

1.一種生產(chǎn)單磷酰類脂a的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌的底盤菌的編碼類脂a合成途徑的酶的基因被替換為外源的編碼類脂a合成途徑的酶的基因，并包含外源的編碼pagl的基因和外源的編碼lpxe的基因。

2.如權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述底盤菌為大腸桿菌w3110或mg1655。

3.如權(quán)利要求1或2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述編碼pagl的基因來(lái)源于沙門氏菌屬；

4.一種制備如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌的底盤菌的編碼類脂a合成途徑的酶的基因?yàn)檫x自以下的一種或多種：lpxa、lpxc、lpxd、lpxb、lpxh、lpxk、lpxl、pagp和lpxm；

6.一種制備單磷酰類脂a的方法，其特征在于，所述方法包括：

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，(1)中，所述的培養(yǎng)的溫度為25-37℃，和/或所述重組大腸桿菌的接種量為0.2％，和/或所述培養(yǎng)基為lb培養(yǎng)基。

8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，(2)中還包括使用有機(jī)溶劑進(jìn)行脂多糖分離的步驟，所述有機(jī)溶劑選自其中一種或多種：乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、氯仿和石油醚；

9.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)單磷酰類脂A的重組大腸桿菌。所述重組大腸桿菌的底盤菌的編碼類脂A合成途徑的酶的基因被替換為外源的編碼類脂A合成途徑的酶的基因，并包含外源的編碼pagL的基因和外源的編碼lpxE的基因。本發(fā)明還公開了一種制備所述重組大腸桿菌的方法、制備單磷酰類脂A的方法和所述大腸桿菌在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。利用本發(fā)明提供的重組大腸桿菌進(jìn)行單磷酰類脂A制備時(shí)無(wú)致病性風(fēng)險(xiǎn)，且菌株自身無(wú)抗生素篩選標(biāo)記，利于安全的、綠色的、大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。也可以作為底盤菌株進(jìn)行類脂A結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步改造。

技術(shù)研發(fā)人員：奕棟,譚俊,湯文,賈佳,李圣愷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28