發明領域本發明涉及一種基于特異性基因實驗對象組確定未知動物源性產品樣品認證的方法，所述特異性基因實驗對象組提供了用于生成對于明確認證有特異性的dna甲基化概況的來源。具體地，dna甲基化概況分析可以用于確定動物源性產品的明確認證。所述明確認證可以包括清真認證(halal)、猶太潔食認證(kosher)等等。

背景技術：

0、發明背景

1、可持續食物生產目前被視為全球最重要的社會需要之一。由于農業和水產養殖業等行業的價值鏈非常復雜，因此已建立了證書來加強消費者關系和信任。然而，證書基于在特定農場的審核，并且可以通過將牲畜從未經認證的農場轉移到經過認證的農場而容易地篡改。此外，可持續農業實踐的監督并不完善，因為它在很大程度上局限于審核。這為行業中的欺詐活動留下了空間，因此存在用于肉類的防篡改分析和認證的迫切需要。

2、進一步地，世界上有些人遵守與他們所信奉的傳統或宗教特別相關的飲食限制。例如，一些猶太人只吃依照猶太法律已被視為猶太潔食的食物。類似地，一些穆斯林教徒可能希望只吃依照伊斯蘭教法律已被視為清真食品的食物。其它人可能具有與其它傳統、宗教、道德準則等等有關的其它飲食限制。包括肉類在內的食物的猶太潔食認證(即，將食品指定為猶太潔食)和清真認證(即，將食品指定為清真食品)兩者均涉及遵守與動物屠宰有關的特定法律。例如，猶太教的屠宰儀式(shechita)和伊斯蘭教的屠宰儀式(zabihah)要求用無鋸齒的刀片一次性干凈利落地橫切動物的頸部，以切斷動物的主要血管并放干動物的血液。健康、安全以及動物福利的考慮要求動物產品且特別是肉類產品的起源應該是可追溯的，使得可以有效且可靠地進行質量保證審核和監控程序。然而，目前不存在準確且可靠地追蹤肉類起源的手段。具體地，除了信任肉類包裝和商店上發現的標簽外，不存在可靠、有效且易于使用的方法用于區分清真肉類和非清真肉類以及猶太潔食肉類和非猶太潔食肉類。也就是說，盡管肉類可能被認證為猶太潔食(即，根據猶太傳統允許的)或清真(即，根據伊斯蘭傳統允許的)，但買家可能無法基于目視檢查確定肉類是否進行適當屠宰。此外，當在餐廳用餐時，顧客可能無法在肉類準備之前查看貼在肉類包裝上的檢查標簽。此外，顧客可能無法基于目視檢查確定肉類由其衍生的動物類型。這可能導致遵守飲食限制的人不愿食用動物產品。

3、動物的身體健康狀況和/或化學狀況可能基于動物已進行屠宰的方式而改變。例如，眾所周知的是對于其可能執行猶太教屠宰或清真屠宰的動物的皮質醇水平可能不同于經歷另一種屠宰手段的動物的皮質醇水平。另外，從不同動物獲得的不同類型的肉類可能與身體差異和/或化學差異相關。例如，來自豬的豬肉的蛋白質可能不同于來自牛的牛肉的蛋白質。還可能存在與特定類型動物的不同品種、特定動物的不同肉塊等等有關的差異。這可能限制將未知肉類樣品與一組已知參考肉類樣品進行比較的有效性。

4、最近的研究已顯示了動物的dna甲基化模式含有關于其飼養條件的重要信息。例如，全基因組的甲基化模式和在dna水平下的變異的比較，揭示了表觀遺傳變異的很大一部分可以與適應性差異和飼養條件(例如鮭魚的圈養)相關(le?luyerj等,2017pnas第114卷,第49期)。

5、koop等人和rhein等人還分別證實了，甲基化模式在死后得到維持，并且無論樣品的分解水平如何都是一致的。仍然影響樣品的甲基化模式的僅有方面之一是dna完整性和樣品中發現的dna量(koop等人，2021international?journal?oflegal?medicine?135:167-173和rhein等人，2015frontiers?in?genetics?6:182)。

6、鑒于上文，迫切需要提供用于鑒定且質量控制生物，特別是食物和更特別地動物源性材料的認證的手段，以滿足與人們嚴格遵循的傳統、宗教、道德準則等等有關的飲食限制。

技術實現思路

0、發明概述

1、本發明嘗試通過提供一種方法來解決上述問題，所述方法使用dna甲基化模式來區分一類動物源性產品與另一類動物源性產品，并且能夠確定動物源性產品由其衍生的動物的宰殺或屠宰方式，并且從而準確且可靠地認證產品。本發明基于以下發現：屠宰動物的手段導致動物的內環境中的壓力，并且這可以通過表觀遺傳學永久改變動物的基因組。特別地，適應所述環境(即屠宰手段)且維持適應的生物模式的能力取決于表觀遺傳機制，包括dna甲基化。特別地，本發明基于以下發現：屠宰動物用于食物消費的方法也可能導致動物的表觀遺傳機制，包括dna甲基化模式中的變化，并且這些模式可能傳遞給可能衍生自所述動物的不同產品。

2、發明人已出乎意料地發現，可以利用這一性質來鑒定基因組上的“表觀遺傳指紋”，其不僅對于一種動物的屠宰方法是特異性的，還可能對于經歷相同屠宰方法的所有動物是特異性的。例如，這些‘表觀遺傳指紋’可能不僅對于以特定方式屠宰的動物是特異性的，而且對于源自該動物(個體)的任何產品是特異性的。基于這些發現，本發明提供了鑒定特定動物的特異性屠宰方法的手段，所述特定動物例如動物源性產品來自其的飼養動物，也稱為牲畜和家禽。特別地，根據本發明的任何方面的方法可以用于確定動物源性產品是否衍生自已以特定方式屠宰的動物。更特別地，根據本發明的任何方面的方法可以用于確定動物源性產品是否衍生自已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰的動物和/或動物是否已流血致死。以這種方式，根據本發明的任何方面的方法可以隨后用于準確且可靠地確定動物的屠宰方法，并且隨后提供和/或確認源于所述動物的任何樣品的認證。進一步地，根據本發明的任何方面的方法還可以用于鑒定任何動物源性產品是否被準確且可靠地認證，特別是當所述認證基于動物的屠宰方法時。

3、根據本發明的一個方面，提供了認證測試動物源性產品樣品的方法，所述方法包含以下步驟：

4、(a)確定從測試動物源性產品樣品獲得的基因組材料內的一個或多個預選甲基化位點的測試甲基化概況；和

5、(b)將從(a)獲得的測試甲基化概況與從衍生出產品樣品的測試動物的相同生物分類群的對照動物獲得的參考甲基化概況進行比較，其中所述對照動物并非通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或所述對照動物并非流血致死，

6、其中與來自對照動物的參考甲基化概況相比(a)的測試甲基化概況中的差異，指示測試動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或測試動物已流血致死，并且測試動物源性產品如此進行認證；和

7、其中所述預選甲基化位點是選自來自對照和測試動物的基因或基因組dna區域的cpg位點，所述基因或基因組dna區域在所述方法的訓練過程中顯示了最高程度的甲基化變異。

8、根據本發明的另一個方面，提供了認證測試動物源性產品樣品的方法，所述方法包含以下步驟：

9、(a)確定從動物源性產品樣品獲得的基因組材料內的至少一個cpg位點的甲基化狀態，

10、(b)將來自(a)的cpg位點的甲基化狀態與衍生出產品樣品的測試動物的相同生物分類群的對照動物的甲基化狀態進行比較，其中所述對照動物并非通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或所述對照動物并非流血致死，

11、其中與對照動物中的cpg位點相比測試動物中(a)的測試甲基化狀態的差異，指示測試動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或測試動物已流血致死，并且測試動物源性產品如此進行認證。

12、根據本發明的再一個方面，提供了認證測試動物源性產品樣品的方法，所述方法包含以下步驟：

13、(a)確定從測試動物源性產品樣品獲得的基因組材料內的一個或多個預選甲基化位點的測試甲基化概況；和

14、(b)將(a)中確定的測試甲基化概況與衍生出產品樣品的測試動物的相同生物分類群的預定參考甲基化概況的實驗對象組進行比較，其中每個預定參考甲基化概況對于明確認證的參考動物是特異性的，所述參考動物：

15、-已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰；和/或

16、-流血致死；

17、其中如果測試甲基化概況與預定參考甲基化概況之一顯著相似，則所述測試動物源性產品樣品具有與預定參考甲基化概況相同的明確認證，并且衍生自已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或流血致死的測試動物，并且測試動物源性產品如此進行認證。

18、如本文所用，術語‘動物源性產品’是指源于動物的產品。特別地，術語‘測試動物源性產品’是指將經歷根據本發明的任何方面的方法的所討論的樣品或對象。來自動物的這些產品可能包括肉類和肉制品，還包括脂肪、肉、血和鮮為人知的產品，例如魚膠和干胃膜(rennet)、家禽產品(肉類和蛋)、乳制品(乳和干酪)和非食物產品例如纖維(羊毛、馬海毛、羊絨、皮革等等)。動物源性產品還可能包括可以使用動物產品(例如脂肪)制備的產品，例如肥皂、面霜等。在一個實例中，動物源性產品是肉類、蛋、血液、腦、精子、乳和提供基因組dna的任何其它組織或樣品。特別地，動物源性產品是肉類。

19、術語‘質量認證’是指由指定認證機構頒發的證書或確認書，其認可特定動物源性產品，包括供人類使用和/或食用的食物的質量。術語‘質量認證’與術語‘認證’可互換使用。這些認證通常在動物源性產品包括待食用的食物的包裝上發現，并且由產品制造商印刷。明確食物質量認證的實例可以包括‘飼養模式(haltungsform)’、‘動物福祉(tierwohl)’、‘非轉基因認證(ohne?gentechnik)’、‘清真認證’、‘猶太潔食認證’和其它安全標簽，所述標簽確認所售產品已依照特定的宗教或安全法規而制備。具體而言，術語‘食物質量認證’是指由指定認證機構頒發的證書或確認書，其認可供人類食用的特定食物的質量、來源或屠宰手段。根據本發明的任何方面，所述認證的質量可以是明確認證的食物質量或明確認證，并且這可以是猶太潔食認證、非猶太潔食認證、清真認證或非清真認證。

20、在一個實例中，根據本發明的任何方面，樣品x的明確認證的食物質量或認證可以是猶太潔食認證、非猶太潔食認證、清真認證或非清真認證。更特別地，猶太潔食認證或清真認證是指樣品x源于通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰的動物。甚至更特別地，所述動物被放干血液。

21、與根據本發明的任何方面的食物組合使用的術語‘猶太潔食’是指符合猶太飲食法(kashrut)的猶太教飲食規定的食物或可以根據哈拉卡律法(halakha)(法律)食用的食物。與肉類有關使用的猶太潔食特別涉及其中動物進行準備用于食用的方式。根據猶太傳統，當肉類來自已根據猶太法律進行屠宰的動物時，肉類可以被視為猶太潔食，其中所述動物通過一刀橫切咽喉到不高于會厭且不低于氣管內纖毛開始的精確深度進行宰殺，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和食管，導致動物流血致死。此類屠宰必須使用一把鋒利的大刀來進行，所述刀在每次屠宰前進行檢查，以確保它沒有不規則之處(例如劃痕和凹痕)。所述屠宰通常還由屠夫或拉比進行。猶太潔食肉類通常是指除豬肉以外的大多數肉類。特別地，猶太潔食肉類可以選自牛肉、雞肉、羔羊肉、羊肉、山羊肉及其混合物。猶太潔食肉類不包括貝類，其根據猶太傳統不允許食用。盡管猶太傳統允許食用脊椎動物魚，但由于不存在屠宰脊椎動物魚的特殊方法，因此所有脊椎動物魚都可以被視為猶太潔食。不落入‘猶太潔食’定義的任何食物或肉類隨后都將被視為‘非猶太潔食’。

22、與根據本發明的任何方面的食物組合使用的術語‘清真’是指符合伊斯蘭教飲食法的食物，且尤其是依照這些要求進行處理和制備的肉類。與制備猶太潔食肉類的方式類似，在伊斯蘭傳統中，動物根據進行屠宰，其中所述動物使用無鋸齒的鋒利刀片一次性干凈利落地橫切頸部進行屠宰，以做出切開咽喉前部、食道和頸靜脈，但不切斷脊髓的傷口。除指示之外，允許的動物應該在念誦伊斯蘭教祈禱詞bismillah后進行屠宰。動物還必須在屠宰后放干血液。屠宰必須由成年穆斯林執行。清真肉類通常是指除豬肉以外的大多數肉類。特別地，清真肉類可以選自牛肉、雞肉、羔羊肉、羊肉、山羊肉及其混合物。盡管伊斯蘭傳統允許食用貝類和脊椎動物魚，但由于不存在制備貝類的特殊方法，因此所有貝類和脊椎動物魚都可以被視為清真。不符合‘清真’定義的任何食物或肉類隨后都將被視為‘非清真’。清真的定義在https://www.smiic.org/en/project/24(于2022年6月8日訪問的伊斯蘭合作組織(organisation?of?islamic?cooperation)(oic)/伊斯蘭國家標準和計量研究所(standards?and?metrology?institute?for?the?islamic?countries)(smiic)，oic/smiic?1:2019清真食品一般要求(general?requirements?for?halal?food))中進一步提供。

23、在本公開中與術語對象和/或動物結合使用的術語“測試”是指經受根據本發明的任何方面的方法的實體，并且是本發明的分析應用的基礎。因此，“(個別)測試對象”、“(個別)測試對象組”或“測試概況”或“測試動物源性產品”是待根據本發明測試的(個別)對象或對象組或者在此上下文獲得或生成的概況。相反地，術語“參考”應該表示用于與測試實體比較的，大多是預定的實體。例如，術語‘參考動物’是指用于比較的動物或作為提及‘測試動物’的對照。類似地，按照本發明的任何方面使用的術語‘樣品’和/或‘測試動物源性產品樣品’是指可以經受本發明的方法的實體。特別地，樣品可以是任何(測試)動物源性產品，其可以經受本發明的方法，以通過首先確定dna甲基化概況，然后將該測試甲基化概況與對照進行比較來確定明確認證。區塊鏈也可以用于使消費者可容易地獲取信息。

24、根據本發明的任何方面的方法可以基于dna甲基化模式用于鑒定未知樣品(即動物源性產品樣品)。然后，可以將這些dna甲基化模式與參考dna甲基化模式進行比較，以將動物源性產品樣品追溯到樣品源于其的屠宰場或農場，然后確定未知樣品是否對應于已根據猶太潔食、清真、非猶太潔食或非清真實踐進行屠宰的動物。以這種方式，肉類的購買者或消費者可以驗證作為猶太潔食或清真食品銷售或上市的肉類是真品。

25、如本文所用，術語“包含”應解釋為涵蓋“包括”和“由……組成”兩者，這兩種含義均有明確意圖，并且因此是本發明的個別公開的方面。當在本文中使用時，“和/或”應被視為兩個指定特征或組分各自連同或不連同另一個的具體公開。例如，“a和/或b”應被視為(i)a、(ii)b以及(iii)a和b各自的具體公開，就像每個在本文中個別地闡述一樣。在本發明的上下文中，術語“約”和“大約”表示本領域技術人員將理解為仍確保所討論的特征的技術效果的準確度區間。所述術語通常指示與所指示數值±20％、±15％、±10％和例如±5％的偏差。如普通技術人員將了解的，關于給定技術效果的數值的具體偏差將取決于技術效果的性質。例如，自然或生物技術效果一般可能具有比人工或工程技術效果更大的此類偏差。當提及單數名詞時使用不定冠詞或定冠詞，例如“一個/種(a)”、“一個/種(an)”或“該/所述(the)”時，除非另有明確說明，否則這包括該名詞的復數。

26、在本發明的上下文中，術語“甲基化概況”、“甲基化模式”、“甲基化狀況”或“甲基化狀態”在本文中用于描述基因組序列的甲基化的狀況、情形或條件，并且此類術語是指在特定基因組基因座處的dna區段與甲基化相關的特性。此類特性包括但不限于該dna序列內的任何胞嘧啶(c)殘基是否被甲基化，甲基化c殘基的定位，在任何特定殘基段處的甲基化c的百分比，以及由于例如等位基因起源中的差異在甲基化中的等位基因差異。

27、術語“甲基化狀態”是指特定甲基化位點的狀態(即甲基化相對于非甲基化)，其意指殘基或甲基化位點是甲基化的或未甲基化的。然后，基于一個或多個甲基化位點的甲基化狀態，可以確定甲基化概況。相應地，術語“甲基化概況”或者也稱“甲基化模式”是指在生物樣品的基因組材料中的任何特定殘基段處的甲基化c殘基或未甲基化c殘基的相對濃度或絕對濃度。例如，如果dna序列內通常并非甲基化的胞嘧啶(c)殘基是甲基化的，則它可以被稱為“高甲基化的”；而如果dna序列內通常甲基化的胞嘧啶(c)殘基并非甲基化的，則它可以被稱為“低甲基化的”。同樣地，如果dna序列內的胞嘧啶(c)殘基(例如，來自測試對象的樣品核酸的dna)與來自不同區域或來自不同個體的另一個序列相比(例如，相對于正常核酸或參考序列的標準核酸)是甲基化的，則該序列與另一個序列相比被視為高甲基化的。可替代地，如果dna序列內的胞嘧啶(c)殘基與來自不同區域或來自不同個體的另一個序列相比是非甲基化的，則該序列與另一個序列相比被視為低甲基化的。這些序列被稱為“差異甲基化的”。可以通過本領域技術人員已知的各種方式完成差異甲基化水平的測量。作為非限制性實例，一種方法是測量通過亞硫酸氫鹽測序方法確定的各個查詢的cpg位點的甲基化水平。

28、術語“高甲基化”是指相對于在正常對照dna樣品內的相應cpg二核苷酸處發現的5-mcyt量，在測試dna樣品的dna序列內的一個或多個cpg二核苷酸處5-mcyt的存在增加所對應的平均甲基化狀況。特別地，對照是指并未通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或并未流血致死的動物源性產品。

29、術語“低甲基化”是指相對于在正常對照dna樣品內的相應cpg二核苷酸處發現的5-mcyt量，在測試dna樣品的dna序列內的一個或多個cpg二核苷酸處5-mcyt的存在減少所對應的平均甲基化狀況。特別地，對照是指并未通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或并未流血致死的動物源性產品。

30、如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸堿基”是指核苷酸堿基上甲基部分的存在，其中所述甲基部分通常不存在于公認的典型核苷酸堿基中。例如，以其通常形式的胞嘧啶在其嘧啶環上不含有甲基部分，但5-甲基胞嘧啶在其嘧啶環的位置5處含有甲基部分。因此，以其通常形式的胞嘧啶可不被視為甲基化核苷酸，而5-甲基胞嘧啶可被視為甲基化核苷酸。在另一個實例中，胸腺嘧啶在其嘧啶環的位置5處可能含有甲基部分，然而，對于本文的目的，胸腺嘧啶在dna中存在時可不被視為甲基化核苷酸。關于dna的典型核苷酸堿基是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤。關于rna的典型堿基是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤。相應地，“甲基化位點”是其中具有發生甲基化的可能性的靶基因核酸區域中的定位。例如，含有cpg的定位是其中胞嘧啶可能是甲基化的或可能并非甲基化的甲基化位點。特別地，術語“甲基化核苷酸”是指攜帶甲基基團的核苷酸，所述甲基基團附著至可發生甲基化的核苷酸位置。這些甲基化核苷酸通常在自然界中發現，并且迄今為止，主要在二核苷酸cpg的背景下出現、但也在cpnpg-和cpnpn-序列的背景下出現的甲基化胞嘧啶可以被認為是最常見的。原則上，其它天然存在的核苷酸也可能是甲基化的，但就本發明的任何方面而言，它們將不加以考慮。

31、如本文所用，“cpg位點”或“甲基化位點”是核酸(dna或rna)內易受甲基化影響的核苷酸，所述甲基化或通過體內天然存在的事件或通過體外使核苷酸化學甲基化的事件。

32、如本文所用，“甲基化的核酸分子”是指含有甲基化的一個或多個核苷酸的核酸分子。

33、如本文所用，術語‘表觀遺傳變化’是指對基因體或其啟動子發生的化學(例如，甲基化)變化或蛋白質(例如，組蛋白)變化。通過表觀遺傳變化，環境因素如飲食、壓力和產前營養可以對從一代傳遞到下一代的基因產生影響。

34、如本文所用，術語“亞硫酸氫鹽”涵蓋任何合適類型的亞硫酸氫鹽，例如亞硫酸氫鈉，或另一種化學試劑，其能夠將胞嘧啶(c)化學轉換為尿嘧啶(u)而不對甲基化胞嘧啶進行化學修飾，并且因此可以用于基于dna的甲基化狀態對dna序列進行差異修飾，例如美國專利公開us?2010/0112595(menchen等人)。如本文所用，“差異修飾”甲基化或非甲基化dna的試劑涵蓋了在過程中修飾甲基化和/或未甲基化dna的任何試劑，通過所述過程可區分產物產生于甲基化和非甲基化dna，從而允許鑒定dna甲基化狀態。此類過程可能包括但不限于化學反應(例如通過亞硫酸氫鹽的c至u轉換)和酶促處理(例如通過甲基化依賴性核酸內切酶的切割)。因此，優先切割或消化甲基化dna的酶是能夠在dna甲基化時以高得多的效率切割或消化dna分子的酶，而優先切割或消化未甲基化dna的酶在dna并非甲基化時表現出明顯更高的效率。

35、在本發明的上下文中，還包含任何“非基于亞硫酸氫鹽的方法”和“非基于亞硫酸氫鹽的定量方法”，以測試在任何給定的待測試甲基化位點處的甲基化狀態。此類術語是指不需要使用亞硫酸氫鹽的用于定量甲基化或非甲基化核酸的任何方法。這些術語還指不需要亞硫酸氫鹽處理的用于制備待定量核酸的方法。非基于亞硫酸氫鹽的方法的實例包括但不限于使用一種或多種甲基化敏感酶用于消化核酸的方法和使用基于甲基化狀態結合核酸的試劑用于分離核酸的方法。術語“甲基敏感酶”和“甲基化敏感限制性酶”是依賴于其dna識別位點的甲基化狀況用于活性的dna限制性核酸內切酶。例如，存在甲基敏感酶，其僅在其dna識別序列并未甲基化時才切割或消化其dna識別序列。因此，未甲基化的dna樣品將被切割成比甲基化的dna樣品更小的片段。類似地，高甲基化的dna樣品不被切割。相比之下，存在甲基敏感酶，其僅在其dna識別序列甲基化時才切割其dna識別序列。如本文所用，術語“切割”、“剪切”和“消化”可互換使用。

36、在本發明的上下文中的“生物樣品”可以包含從對象或對象組獲得的含有基因組材料的任何生物材料，并且可以是液體、固體或兩者，可以是組織或骨骼，或體液例如血液、淋巴等。特別地，可用于本發明的生物樣品可以包含生物細胞或其片段。

37、如本文所用，術語“預選甲基化位點”是指選自在所述方法的訓練過程中顯示最高程度的甲基化變異的基因或區域的甲基化位點，并且滿足某些質量標準例如考慮≥5x的最小測序覆蓋率并且共≥5個合格的cpg位點。另外，由于其動態范圍有限，可以排除具有<0.1的平均甲基化水平或>0.9的平均甲基化水平的基因。“參考甲基化概況”可以使用多元統計方法例如主成分分析或多維尺度分析，基于多重訓練樣品進行定義。特別地，根據本發明的任何方面，特別是預選甲基化位點中的cpg位點選自下表a：

38、

39、

40、在本發明的上下文中使用的術語“預定參考概況”是指確認為正確標記或認證的一類參考動物源性產品的基因組材料的典型或標準甲基化概況。在一個實例中，預定參考概況可以在對照動物的背景下使用，其中所述對照動物已被正確認證(即其中所述對照動物既不是通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，也不是流血致死)。因此，對照動物可能已使用非清真和非猶太潔食屠宰手段進行屠宰，所述手段可以稱為正常屠宰手段。關于對照動物的預定參考概況的實驗對象組可以包括來自不同樣品的概況，所述不同樣品已得自對照動物(并非通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，也不是流血致死)的不同部位。例如，預定參考概況的實驗對象組可以包括至少一個關于蛋的概況、至少一個關于肉類(肌肉、組織、器官等)的概況、至少一個關于乳的概況等等。這些樣品各自可能具有其自身獨特的預定甲基化參考概況，其也構成預定參考概況的實驗對象組的一部分。

41、在另一個實例中，預定參考概況可以在參考動物的背景下使用，所述參考動物可能已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或已流血致死。可以對于來自動物的不同樣品制備預定參考概況的實驗對象組，所述動物已確認為通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或已流血致死。此處再次，可以存在關于衍生自動物的每種產品的預定參考概況的實驗對象組，所述動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或已流血致死。例如，預定參考概況的實驗對象組可以包括來自動物的至少一個關于蛋的概況、至少一個關于肉類(肌肉、組織、器官等)的概況、至少一個關于乳的概況等等，所述動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或已流血致死。這些樣品各自可能具有其自身獨特的預定甲基化參考概況，其也構成預定參考概況的實驗對象組的一部分。

42、例如，對照可以是與具有已知認證的動物源性產品樣品或未知樣品相同物種或相同動物分類群的一種類型的肉類。可替代地，預定參考概況可以從具有已知認證的不同類型的肉類獲得。在一個實例中，對照可以是認證為‘清真’的雞肉。清真雞肉可以是雞的不同部位(即胸肉、大腿肉、腎臟、肝臟等)的混合物。在另一個實例中，清真雞肉可能來自雞的一個部位。從清真雞肉中，可以獲得甲基化概況作為預定參考概況(對照)，其可以通過確定測試樣品的甲基化概況是否與預定參考概況顯著相似，用于確定測試樣品(肉類)是清真還是非清真的。來自一個動物物種的不同類型的清真肉類的甲基化概況可能是相同的。來自不同動物物種的不同類型的清真肉類的甲基化概況也可能是相同的。在一個實例中，對照可以是認證為“猶太潔食”的雞肉。猶太潔食雞肉可以是雞的不同部位(即胸肉、大腿肉、腎臟、肝臟等)的混合物。在另一個實例中，猶太潔食雞肉可能來自雞的一個部位。從猶太潔食雞肉中，可以獲得甲基化概況作為預定參考概況(對照)，其可以通過確定測試樣品的甲基化概況是否與預定參考概況顯著相似，用于確定測試樣品(肉類)是猶太潔食還是非猶太潔食的。來自一個動物物種的不同類型的猶太潔食肉類的甲基化概況可能是相同的。來自不同動物物種的不同類型的猶太潔食肉類的甲基化概況也可能是相同的。

43、可能存在幾種預定參考概況的匯集，并且將測試樣品的甲基化概況與匯集中的預定參考概況進行比較可能使得能夠鑒定與測試樣品的甲基化概況(顯著)相似的特異性預定參考概況，并且然后測試樣品可以確認為是否通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或是否已流血致死。在一個實例中，預定參考概況可以包括來自動物(雞、山羊、牛、羔羊、綿羊等)的不同部位的肉類(即胸部、大腿、腎臟、肝臟、肩膀、肋骨、腸等)的甲基化概況，所述動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或已流血致死。

44、特別地，根據本發明的任何方面的預定參考甲基化概況的實驗對象組對于不同的測試動物源性產品是明確的。也就是說，每個預定參考甲基化概況對于單個動物源性產品是明確的。因此，預定參考甲基化概況的實驗對象組可以包括來自與測試動物相同生物分類群的動物或幾種動物的不同部位的許多不同的預定參考甲基化概況。還將存在關于不同動物分類群的預定參考甲基化概況的不同實驗對象組，并且關于動物分類群特有的預定參考甲基化概況的相關實驗對象組將取決于測試動物的動物分類群。

45、在本公開的上下文中，且特別是在甲基化概況比較(例如測試概況(來自測試對象(即樣品x))和參考概況之間的比較)的上下文中，術語“顯著相似的”應該意指通過統計工具(即通過使用生物信息學)和/或還通過使用眼睛的觀察所觀察到的相似性。例如，如果通過多元統計方法例如主成分分析或多維尺度分析，測試概況與由多重訓練樣品定義的參考概況重疊，則觀察到顯著相似性。特別地，如果超過50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％的甲基化模式/概況與其參考概況重疊，則測試概況與預定參考概況顯著相似。測試概況與多于一個例如兩個、三個或甚至所有參考概況的相似性都降低相似性的意義。當然，測試甲基化概況與參考甲基化概況的相似性考慮了在所有方法中出現的實驗誤差。

46、動物源性產品樣品可以是單一類型的肉類、不同類型的肉類、一種類型的肉類的單一部分、單一類型的肉類的不同部分或不同類型的肉類的不同部分。樣品可以來自具有dna基因組和dna基因組甲基化的任何生物實體。特別地，甲基化位點是cpg位點。生物實體可以是除豬以外的任何動物。特別地，動物可以選自雞、羔羊、駱駝、牛、山羊、綿羊、馬、驢、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、兔和騾子。更特別地，動物可以選自牛、綿羊、山羊、駱駝、雞、鵝、鴨和火雞。因此，術語‘肉類’在本文中可以理解為包括雞肉、羔羊肉、牛肉、羊肉、山羊肉、駱駝肉、雞肉、鵝肉、鴨肉、火雞肉及其混合物。

47、(a)中的一個或多個預選甲基化位點是與組織特異性基因表達相關的甲基化位點，優選地其中所述預選甲基化位點與一種明確組織的基因表達相關。

48、所述組織可以選自

49、(i)代謝組織例如腸道組織，所述腸道組織優選為回腸或空腸，

50、(ii)肌肉組織，

51、(iii)皮膚組織，和

52、(iv)器官組織，所述器官組織優選為肝臟和/或胰腺組織。

53、根據本發明的再一個方面，提供了驗證已認證為衍生自測試動物的測試動物源性產品樣品的認證的方法，所述測試動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或流血致死，所述方法包含以下步驟：

54、(a)確定從測試動物源性產品樣品獲得的基因組材料內的一個或多個預選甲基化位點的測試甲基化概況；和

55、(b)將從(a)獲得的測試甲基化概況與從衍生出產品樣品的測試動物的相同生物分類群的對照動物獲得的參考甲基化概況進行比較，其中所述對照動物并非通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或所述對照動物并非流血致死

56、其中與來自對照動物的參考甲基化概況相比(a)的測試甲基化概況中的差異，指示測試動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或測試動物已流血致死，并且測試動物源性產品得到正確認證，和

57、其中與對照動物的參考甲基化概況相比(a)的測試甲基化概況中的相似性，指示測試動物并未通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或測試動物已流血致死，并且測試動物源性產品得到錯誤認證，和

58、其中所述預選甲基化位點是選自來自對照和測試動物的基因或基因組dna區域的cpg位點，所述基因或基因組dna區域在所述方法的訓練過程中顯示了最高程度的甲基化變異。

59、根據本發明的一個進一步的方面，提供了用于確認或拒絕動物源性產品樣品的假定認證的方法，所述方法包含：

60、-將從動物源性產品樣品的基因組材料獲得的測試甲基化概況與從衍生出產品樣品的測試動物的相同生物分類群的對照動物獲得的參考甲基化概況進行比較，其中所述對照動物并非通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或所述對照動物并非流血致死，

61、其中與來自對照動物的參考甲基化概況相比測試甲基化概況中的差異，指示測試動物已通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或測試動物已流血致死

62、其中所述假定認證是測試動物源性產品樣品是猶太潔食或清真食品，其中所述測試動物通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或所述測試動物流血致死。

63、根據本發明的另一個方面，提供了確定測試動物源性產品樣品是否得自已流血致死或通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰的測試動物的方法，所述方法包含：

64、-將從測試動物源性產品樣品的基因組材料獲得的測試甲基化概況與從衍生出產品樣品的測試動物的相同生物分類群的對照動物獲得的參考甲基化概況進行比較，其中所述對照動物并非通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，和/或所述對照動物并非流血致死。

65、特別地，當動物通過橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰時，認證是猶太潔食認證或清真認證。另外或可替代地，當動物被放干血液時，認證是猶太潔食認證或清真認證。

66、根據本發明的再一個進一步的方面，提供了測試動物源性產品樣品的認證，其認證了測試動物通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰，

67、其中用于確定測試動物通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰的方法包含以下步驟：

68、(a)確定測試動物源性產品樣品中包含的基因組材料內的一個或多個預選甲基化位點的測試甲基化概況；和

69、(b)將(a)中確定的測試甲基化概況與衍生出產品樣品的測試動物的相同生物分類群的預定參考甲基化概況的實驗對象組進行比較，其中每個預定參考甲基化概況來自不同的參考動物和/或不同的供應商，

70、其中如果(a)的測試甲基化概況與預定參考甲基化概況之一顯著相似，則測試動物通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰。

71、另外或可替代地，測試動物被放干血液。

72、根據本發明的再一個方面，提供了dna甲基化概況分析用于確定動物源性產品樣品的認證的用途。特別地，當測試動物通過一刀橫切咽喉，切斷雙側頸動脈、雙側頸靜脈、雙側迷走神經、氣管和/或食道進行屠宰和/或測試動物流血致死時，動物源性產品樣品的認證是猶太潔食認證或清真認證。