背景技術：

1、對長基因組dna進行測序可能頗具挑戰性。許多測序平臺，例如dnbseq測序儀和illumina測序儀，并不是為測序長dna分子而設計的。例如，從長dna分子中生成dnb并獲取足夠的模板副本以在dnbseq測序儀中進行高質量測序可能很困難。illumina測序儀通常需要進行橋式擴增，而長dna分子的橋式擴增往往效率低下。此外，使用這些系統可能讀取的長度通常小于500個堿基，因此無法對這些分子的中間進行測序。因此，盡管這些mps測序平臺具有成本效益和效率，但從這些平臺獲得的序列讀數長度有限。對具有高度重復核苷酸序列的dna分子進行測序還存在其他挑戰；例如，通常很難辨別兩個相同的序列讀數是否與基因組中的不同位置相關，或者它們是否僅僅是基因組中相同位置的重復序列讀數。因此，仍然需要準備測序文庫，以便能夠以準確和有效的方式從短序列讀數中收集長dna分子的序列信息。

技術實現思路

1、在一個方面，本文公開了制備用于測序的單鏈帶銜接頭的構建體的方法，任選地不使用納米滴，包括：制備單鏈核酸構建體的多個嵌套組，任選地在單個混合物中，其中每個嵌套組中的每個單鏈核酸構建體包含靶序列部分，該靶序列部分的兩翼在5’端是第一銜接頭序列并且在3’端是第二銜接頭序列，其中第一銜接頭序列從5’到3’包含引物結合序列、條形碼序列和第一雜交序列并且第二銜接頭序列包含第二雜交序列，其中第一和第二雜交序列彼此互補，其中每個靶序列部分具有第一端和第二端，其中第一端與條形碼序列之間的距離短于第二端與條形碼序列之間的距離，其中每個嵌套組中的每個單鏈核酸構建體共享相同的條形碼序列并且不同嵌套組中的單鏈核酸構建體具有不同的條形碼序列，并且其中對于單鏈核酸構建體的每個嵌套組，該嵌套組中的靶序列部分在第一端附近具有相同的核苷酸序列并且在第二端附近由于截短而彼此不同，使得單鏈核酸構建體的每個嵌套組包含具有不同長度的多個靶序列部分。

2、在另一個方面，本文公開了一種產生包含單鏈帶銜接頭的構建體的單鏈dna環以供測序的方法，任選地不使用納米滴，包括：在單個混合物中制備單鏈核酸構建體的多個嵌套組，其中每個嵌套組中的每個單鏈核酸構建體包含兩翼是第一銜接頭序列和第二銜接頭序列的靶序列部分，其中第一銜接頭序列包含條形碼序列和引物結合序列，其中每個靶序列部分具有第一端和第二端，其中第一端與條形碼序列之間的距離短于第二端與條形碼序列之間的距離，其中每個嵌套組中的單鏈核酸構建體共享相同的條形碼序列，并且不同嵌套組中的單鏈核酸構建體具有不同的條形碼序列，其中對于單鏈核酸構建體的每個嵌套組，(a)該嵌套組中的靶序列部分在第一端附近具有相同的核苷酸序列并且在第二端附近由于截短而彼此不同，使得單鏈核酸構建體的每個嵌套組包括具有不同長度的多個靶序列部分，以及(b)將每個嵌套組中的單鏈核酸構建體環化以產生單鏈dna環，其中第一銜接頭序列與第二銜接頭序列連接。

3、在另一個方面，本文公開了一種產生包含單鏈帶銜接頭的構建體的單鏈dna環以進行測序的方法，任選地不使用納米滴，包括：在單個混合物中，制備單鏈核酸構建體的多個嵌套組，其中每個嵌套組中的每個單鏈核酸構建體包含兩翼是第一銜接頭序列和第二銜接頭序列的靶序列部分，其中第一銜接頭序列包含條形碼序列和引物結合序列，其中每個靶序列部分具有第一端和第二端，其中第一端與條形碼序列之間的距離短于第二端與條形碼序列之間的距離，其中每個嵌套組中的單鏈核酸構建體共享相同的條形碼序列，并且不同嵌套組中的單鏈核酸構建體具有不同的條形碼序列，其中對于單鏈核酸構建體的每個嵌套組，(a)該嵌套組中的靶序列部分在第一端附近具有相同的核苷酸序列并且通過在第二端附近截斷彼此不同，使得單鏈核酸構建體的每個嵌套組包含具有不同長度的多個靶序列部分，以及(b)將每個嵌套組中的單鏈核酸構建體環化以產生單鏈dna環，其中第一銜接頭序列和第二銜接頭序列相連。

4、在另一個方面，本文公開了一種制備用于測序的雙鏈帶銜接頭的構建體的方法，任選地不使用納米滴，其中該方法包括：(i)擴增多個基因組片段，每個基因組片段包含靶序列，以在混合物中產生多組擴增的核酸片段，其中每組中的擴增的核酸片段共享相同的靶序列，任選地使用靶特異性引物進行擴增，對于每組，該方法還包括(ii)使擴增的核酸片段與酶接觸，其中酶在擴增的核酸片段中引入斷裂，(iii)將片段的混合物分配成多個等分試樣，(iv)對片段的等分試樣進行切口平移以在一定條件下合成dna鏈，使得在不同等分試樣中合成的dna鏈具有不同的長度，其中dna鏈中的每個包含具有第一端和第二端的靶序列部分，并且其中不同等分試樣中的dna鏈在第一端附近共享相同序列并且在第二端附近具有不同序列，(v)對于每個等分試樣，經由分支連接將第二銜接頭連接到(iv)中合成的dna鏈的第二端，其中每個第二銜接頭為包含第一銜接頭寡核苷酸和第二銜接頭寡核苷酸的部分雙鏈銜接頭，其中第一銜接頭寡核苷酸和第二銜接頭寡核苷酸兩者互補且彼此雜交，其中第二銜接頭中的每個包含位置條形碼序列，其中每次連接包括將第二銜接頭的第一銜接頭寡核苷酸的5-引物端連接至合成dna鏈的第二端，其中連接至不同等分試樣中的合成dna鏈的第二端的第一銜接頭寡核苷酸包含不同的位置條形碼序列，并且連接至相同等分試樣中的合成dna鏈的第二端的第一銜接頭寡核苷酸共享相同的位置條形碼序列，(vi)將來自(v)的不同等分試樣的與第二銜接頭連接的合成dna鏈合并在單個混合物中，(vii)延伸與已連接至合成dna鏈的第一銜接頭寡核苷酸雜交的引物以產生具有平端的雙鏈片段，以及(viii)從單個混合物中任選地選擇(vii)的雙鏈片段，其大小范圍為200bp-1.5kb，例如300bp-1.2kb、300bp-1kb或500-1000bp，以及(ix)將第三銜接頭連接到雙鏈片段的平端，從而產生雙鏈帶銜接頭的構建體。

5、在另一個方面，本文公開了一種用于制備帶銜接頭的片段的多個嵌套組的方法，任選地不使用納米滴，其中每個帶銜接頭的片段是單鏈核酸，其包含具有第一端和第二端的靶序列片段、5-引物銜接頭序列、3-引物銜接頭序列、引物序列和條形碼序列，其中在帶銜接頭的片段的每個嵌套組中，靶序列片段在第一端具有相同的核苷酸序列并且在第二端由于截短而彼此不同，使得帶銜接頭的片段的每個嵌套組包含具有不同長度的多個靶序列片段，其中第一端比第二端更靠近條形碼序列，其中該方法包括：(a)在單個混合物的反應中提供單鏈dna多聯體群體，其中每個多聯體包含多個相同的單體，并且每個單體包含靶序列的補體、標識多聯體的條形碼序列補體，以及單鏈多聯體群體共享的引物結合序列，其中引物結合序列包含與引物序列互補的序列，其中引物結合序列和條形碼序列補體兩者均在靶序列的補體的3-引物處；(b)將包含引物序列的引物退火至多個多聯體中每一個多聯體的多個單體的引物結合序列；(c)利用具有5'-->3'外切核酸酶活性并且不具有鏈置換活性的dna聚合酶延伸與引物結合序列雜交的至少一些引物，其中該延伸產生多個延伸引物，每個所述延伸引物包含具有條形碼序列和引物序列的靶序列片段，其中延伸引物與多聯體雜交；其中延伸引物以間隔隔開，并且(d)將多個延伸引物與包含5-引物銜接頭序列的5-引物銜接頭、包含3-引物銜接頭序列的3-引物銜接頭、dna連接酶和具有單鏈dna外切核酸酶活性的外切核酸酶在外切核酸酶降解延伸引物中的一部分靶序列片段的條件下接觸，以產生縮短的延伸引物，5-引物銜接頭連接到縮短的延伸引物的5'端，3-引物銜接頭連接到縮短的延伸引物的3'端，從而產生帶銜接頭的片段的多個嵌套組群。

6、在另一個方面，本文公開了一種用于制備帶銜接頭的片段的多個嵌套組的方法，任選地不使用納米滴，其中每個帶銜接頭的片段是單鏈核酸，其包含具有第一端和第二端的靶序列片段、5-引物銜接頭序列、3-引物銜接頭序列、引物結合序列和條形碼序列補體，其中在帶銜接頭的片段的每個嵌套組中，靶序列片段在第一端具有相同的核苷酸序列并且在第二端彼此不同，使得帶銜接頭的片段的每個嵌套組包含具有不同長度的多個靶序列片段，其中第一端比第二端更靠近條形碼序列，其中該方法包括(a)提供包含條形碼序列、靶序列和引物結合序列的條形碼化片段，其中條形碼化片段在一個末端固定在珠子上，(b)將包含5-引物銜接頭序列的引物退火到條形碼化片段中的引物結合序列，其中5-引物銜接頭序列包含i)條形碼序列補體，和ii)與條形碼化片段中的引物結合序列互補的引物序列，(c)延伸引物以產生包含靶序列片段和條形碼序列補體的延伸引物，(d)使延伸引物與包含3-引物銜接頭序列的分支銜接頭接觸以產生帶銜接頭的片段，(e)將帶銜接頭的片段與仍然固定在珠子上的條形碼化片段分離，以及(f)在延伸控制條件下重復步驟(b)-(e)一個或多個循環以產生一個或多個帶銜接頭的片段，其中從步驟(e)產生的帶銜接頭的片段和從步驟(f)產生的帶銜接頭的片段構成帶銜接頭的片段的嵌套組，并且其中每個嵌套組中的帶銜接頭的片段包含具有不同長度的靶序列片段。

7、在另一個方面，本文公開了一種用于制備多組帶銜接頭的片段的方法，任選地不使用納米滴，其中每個帶銜接頭的片段是單鏈核酸，其包含具有第一端和第二端的靶序列片段、5-引物銜接頭序列、3-引物銜接頭序列、引物結合序列和條形碼序列補體，其中該方法包括：(a)提供包含條形碼序列、靶序列和引物結合序列的條形碼化片段，其中條形碼化片段在一個末端固定在珠子上，(b)將包含5-引物銜接頭序列的引物退火至條形碼化片段中的引物結合序列，其中5-引物銜接頭序列包含i)條形碼序列補體，和ii)與條形碼化片段中的引物結合序列互補的引物序列，(c)延伸引物以產生包含靶序列片段和條形碼序列補體的延伸引物，(d)使延伸引物與包含含有簡并序列區域的3-引物部分的第一分支銜接頭接觸，從而形成包含3-引物部分處的簡并序列區域的第一延伸產物，其中3-引物部分通過簡并序列區域與條形碼化片段雜交，(e)延伸第一延伸產物的3-引物部分以產生第二延伸產物，以及(f)使第二延伸產物與第二分支銜接頭接觸以產生帶銜接頭的片段。

8、在另一個方面，本文公開了一種dna復合物，其包含(a)固定在固體支持物上的條形碼化片段，其中條形碼化片段包含條形碼序列和靶序列，以及(b)與條形碼化片段雜交的多核苷酸，其中多核苷酸包括包含條形碼序列補體的5-引物部分、包含靶序列片段的3-引物部分，其中5-引物部分和3-引物部分退火至條形碼化片段，而中間部分不退火至條形碼化片段，從而形成氣泡。

9、在另一個方面，本文公開了一種組合物，其包含帶銜接頭的片段的嵌套組，每者包含條形碼序列和具有第一端和第二端的靶序列片段、5-引物銜接頭序列和3-引物銜接頭序列，其中靶序列片段在第一端具有相同的核苷酸序列并且在第二端由于截短而彼此不同，使得帶銜接頭的片段的嵌套組包含具有不同長度的多個靶序列片段，并且其中帶銜接頭的片段的嵌套組共享相同的條形碼序列。