1.本技術(shù)案涉及嵌合抗原受體(car)、工程化免疫細(xì)胞(例如，nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞及t細(xì)胞)，及其使用方法。本文提供的嵌合抗原受體可增強(qiáng)工程化nk細(xì)胞的殺滅活性。
背景技術(shù)：
：：0、2.
背景技術(shù)：
：1、免疫療法已成為有前景的癌癥治療方法。已證實(shí)，表現(xiàn)嵌合抗原受體(car)的t細(xì)胞對(duì)液體腫瘤有效，但是對(duì)實(shí)體腫瘤僅有極有限的效果(porter等人(2011)chimericantigen?receptor-modified?t?cells?in?chronic?lymphoid?leukemia.n?engl?jmed.365(8):725-33；ahmed等人(2015)autologous?her2?cmv?bispecific?car?t?cellsare?safe?and?demonstrate?clinical?benefit?for?glioblastoma?in?a?phase?itrial.j?immunother?cancer.3(增刊2):o11；fesnak等人(2016)engineered?t?cells:thepromise?and?challenges?of?cancer?immunotherapy.nat?rev?cancer.16(9):566-81)。2、自然殺傷細(xì)胞(nk)是自然免疫系統(tǒng)必不可少的部分，且構(gòu)成針對(duì)腫瘤的第一防御線(campbell等人(2013)natural?killer?cell?biology:an?update?and?futuredirections.j?allergy?clin?immunol.132(3):536-544)。由于nk細(xì)胞的獨(dú)特生物性質(zhì)，嵌合抗原受體工程化的nk細(xì)胞(嵌合抗原受體-nk)已變得更具吸引力。首先，嵌合抗原受體-nk細(xì)胞與嵌合抗原受體-t細(xì)胞相比具有更高安全性，包括細(xì)胞激素釋放癥候群(crs)及神經(jīng)毒性的風(fēng)險(xiǎn)降低、移植物抗宿主病(gvhd)的風(fēng)險(xiǎn)降低(liu等人(2020)use?of?car-transduced?natural?killer?cells?in?cd19-positive?lymphoid?tumors.nengl?jmed.382(6):545-553；lupo等人(2019)natural?killer?cells?as?allogeneic?effectorsin?adoptive?cancer?immunotherapy.cancers(basel).11(6):769)。其次，嵌合抗原受體-nk細(xì)胞的多功能性能夠以嵌合抗原受體特異性方式殺滅靶腫瘤細(xì)胞。此外，nk細(xì)胞透過許多組成型表達(dá)的激活受體(例如ncr、nkg2d、dnam-1、激活kir(kir2ds1、kir2ds4、kir2dl4)、cd16介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)及trail或fasl誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，展示出針對(duì)腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)效細(xì)胞毒性(oei等人(2018)intrinsic?functional?potential?of?nk-cellsubsets?constrains?retargeting?driven?by?chimeric?antigen?receptors.cancerimmunol?res.6(4):467-480；sun等人(2015)nk?cell?receptor?imbalance?and?nk?celldysfunction?in?hbv?infection?and?hepatocellular?carcinoma.cell?mol?immunol.12(3):292-302；wu等人(2019)role?of?adam17?as?a?regulatory?checkpoint?of?cd16a?innk?cells?and?as?a?potential?target?for?cancer?immunotherapy.j?leukoc?biol.105(6):1297-1303)。第三，嵌合抗原受體-nk細(xì)胞已有現(xiàn)成產(chǎn)品，從而消除個(gè)體化及患者特異性產(chǎn)品的需求。由于出現(xiàn)同種異體反應(yīng)性及gvhd的風(fēng)險(xiǎn)很小，從而具有潛在的可能性，來采用同種異基因嵌合抗原受體-nk細(xì)胞的各種產(chǎn)品來源，包括nk細(xì)胞系、外周血單核細(xì)胞(pbmc)及多能干細(xì)胞(ipsc)(shimasaki等人(2020)nk?cells?for?cancerimmunotherapy.nat?rev?drug?discov.19(3):200-218；ueda等人(2020)non-clinicalefficacy,safety?and?stable?clinical?cell?processing?of?induced?pluripotentstem?cell-derived?anti-glypican-3chimeric?antigen?receptor-expressing?naturalkiller/innate?lymphoid?cells.cancer?sci.111(5):1478-1490)。3、大多數(shù)nk嵌合抗原受體，包括最新的臨床試驗(yàn)中研究的car-nk，均使用t細(xì)胞衍生的嵌合抗原受體，例如scfv-cd8a鉸鏈-cd28?tm及icd-cd3ζ。已有報(bào)導(dǎo)稱，nk特異性嵌合抗原受體較nk細(xì)胞中表達(dá)的t嵌合抗原受體更佳(li等人(2018)human?ipsc-derivednatural?killer?cells?engineered?with?chimeric?antigen?receptors?enhance?anti-tumor?activity.cell?stem?cell.23(2):181-192.e5)。4、3.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：5、本技術(shù)的一個(gè)方面提供了嵌合抗原受體(car)。在某些實(shí)施例中，本文提供的嵌合抗原受體(car)包含：6、(i)細(xì)胞外抗原結(jié)合域；7、(ii)跨膜域；及8、(iii)包含衍生自第一多肽的細(xì)胞內(nèi)域的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，9、其中，衍生自所述第一多肽的所述細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由肽連接子連接至所述跨膜域的c端，且10、其中所述第一多肽為dap10或dap12。11、在某些實(shí)施例中，本文提供了一種嵌合抗原受體(car)，其包含：12、(i)細(xì)胞外抗原結(jié)合域；13、(ii)包含衍生自第二多肽的跨膜域的跨膜域；及14、(iii)包含衍生自第一多肽的細(xì)胞內(nèi)域的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，15、其中所述第二多肽不同于所述第一多肽，16、其中衍生自所述第一多肽的所述細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由肽連接子連接至衍生自所述第二多肽的所述跨膜域的c端，且其中所述第一多肽為dnam1。17、在某些實(shí)施例中，所述car的所述跨膜域包含衍生自第二多肽的跨膜域，其中所述第二多肽不同于所述第一多肽，且其中衍生自所述第一多肽的所述細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由肽連接子連接至衍生自所述第二多肽的所述跨膜域的c端。18、在某些實(shí)施例中，所述car的所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域進(jìn)一步包含衍生自第三多肽的細(xì)胞內(nèi)域，其中所述第三多肽不同于所述第一多肽。19、在某些實(shí)施例中，所述第二多肽及所述第三多肽為相同多肽。20、在某些實(shí)施例中，所述car進(jìn)一步包含在所述細(xì)胞外抗原結(jié)合域的c端與所述跨膜域的n端之間的鉸鏈域。21、在某些實(shí)施例中，所述car的所述鉸鏈域包含衍生自所述第二多肽的鉸鏈域。22、在某些實(shí)施例中，所述第二多肽或所述第三多肽為信號(hào)傳導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子家族(slamf)受體、cd2、cd28h、dnam1、cd28、4-1bb、ox40、kir-s、nkg2c或nkg2e。在某些實(shí)施例中，所述slamf受體為slamf4(cd244、2b4)、slamf3(cd229、ly9)、slamf6(cd352、ntb-a、sf2000)、slamf5(cd84)、slamf7(cd319、cracc、cs1)、slamf1(cd150)、slamf2(cd48、fimh)、slamf8(cd353)或slamf9(cd84h1、sf2001)。在某些實(shí)施例中，所述kir-s為kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、kir2ds5或kir3ds1。23、在某些實(shí)施例中，所述car的所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域進(jìn)一步包含衍生自cd3ζ的細(xì)胞內(nèi)域。24、在某些實(shí)施例中，所述car的所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域進(jìn)一步包含衍生自slam相關(guān)蛋白(sap)的細(xì)胞內(nèi)域。在某些實(shí)施例中，所述car的所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域進(jìn)一步包含衍生自尤因氏(ewing's)肉瘤激活轉(zhuǎn)錄本-2(eat2)的細(xì)胞內(nèi)域。25、在某些實(shí)施例中，衍生自cd3ζ的所述細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由肽連接子連接至衍生自sap的所述細(xì)胞內(nèi)域或衍生自eat2的所述細(xì)胞內(nèi)域。在某些實(shí)施例中，衍生自cd3ζ的所述細(xì)胞內(nèi)域經(jīng)由p2a、t2a或e2a連接至衍生自sap的所述細(xì)胞內(nèi)域或衍生自eat2的所述細(xì)胞內(nèi)域。26、在某些實(shí)施例中，所述car的所述細(xì)胞外抗原結(jié)合域包含scfv。在某些實(shí)施例中，所述car的所述細(xì)胞外抗原結(jié)合域結(jié)合至腫瘤抗原或其片段。27、在某些實(shí)施例中，所述第一多肽為dap10。28、在某些實(shí)施例中，所述car包含與seq?id?no:20的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。29、在某些實(shí)施例中，所述car包含與seq?id?no:86的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。30、在某些實(shí)施例中，所述car包含與seq?id?no:87的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。31、在某些實(shí)施例中，所述car包含與seq?id?no:105、seq?id?no:106、seq?id?no:107、seq?id?no:108、seq?id?no:109、seq?id?no:110、seq?id?no:111、seq?id?no:112、seqid?no:113、seq?id?no:114、seq?id?no:115、seq?id?no:116、seq?id?no:117、seq?id?no:118、seq?id?no:119、seq?id?no:120、seq?id?no:121、seq?id?no:122、seq?id?no:123、seqid?no:124、seq?id?no:125、seq?id?no:126、seq?id?no:127、seq?id?no:128、seq?id?no:129、seq?id?no:130、seq?id?no:131、seq?id?no:132、seq?id?no:133、seq?id?no:134、seqid?no:135、seq?id?no:136、seq?id?no:137、seq?id?no:138、seq?id?no:139、seq?id?no:140、seq?id?no:141、seq?id?no:142、seq?id?no:143、seq?id?no:144或seq?id?no:145的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。32、在某些實(shí)施例中，所述car自n端至c端包含：33、(i)細(xì)胞外抗原結(jié)合域；34、(ii)包含衍生自所述第二多肽的跨膜域的跨膜域；35、(iii)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，其包含36、(iii)-(a)衍生自dap10的細(xì)胞內(nèi)域；37、(iii)-(b)衍生自cd3ζ的細(xì)胞內(nèi)域；及38、(iii)-(c)衍生自sap的細(xì)胞內(nèi)域或衍生自eat2的細(xì)胞內(nèi)域，其中所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域內(nèi)的這些細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)肽連接子彼此連接，且其中所述細(xì)胞外抗原結(jié)合域、所述跨膜域及所述細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)肽連接子彼此連接。39、本技術(shù)的第二方面提供了工程化免疫細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，本文提供了包含前述car的工程化免疫細(xì)胞，其中所述工程化免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞或t細(xì)胞。40、在某些實(shí)施例中，本文提供了一種包含car的工程化免疫細(xì)胞，其中所述car包含：41、(i)細(xì)胞外抗原結(jié)合域；42、(ii)跨膜域；及43、(iii)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，且44、其中所述工程化免疫細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼衍生自slam相關(guān)蛋白(sap)的細(xì)胞內(nèi)域的外源引入的多核苷酸，且其中所述工程化免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞或t細(xì)胞。45、在某些實(shí)施例中，本文提供了一種包含car的工程化免疫細(xì)胞，其中所述car包含：46、(i)細(xì)胞外抗原結(jié)合域；47、(ii)跨膜域；及48、(iii)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，且49、其中所述工程化免疫細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼衍生自尤因氏肉瘤激活轉(zhuǎn)錄本-2(eat2)的細(xì)胞內(nèi)域的外源引入的多核苷酸，且其中所述工程化免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞或t細(xì)胞。50、在某些實(shí)施例中，所述多核苷酸編碼所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car，且其中所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car的所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域包含衍生自sap的所述細(xì)胞內(nèi)域或衍生自eat2的所述細(xì)胞內(nèi)域。51、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car的所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域包含衍生自第一多肽的細(xì)胞內(nèi)域，且其中所述第一多肽為dap10、dnam1、cd28h、cd2、dap12、cd28或ox40。52、在某些實(shí)施例中，所述第一多肽的所述細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由肽連接子連接至所述跨膜域的c端。53、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car的所述跨膜域包含衍生自第二多肽的跨膜域。54、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car的所述細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域包含衍生自第三多肽的細(xì)胞內(nèi)域。55、在某些實(shí)施例中，所述第二多肽或所述第三多肽為信號(hào)傳導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子家族(slamf)受體、cd2、cd28h、dnam1、cd28、4-1bb、ox40、kir-s、nkg2c或nkg2e。在某些實(shí)施例中，所述slamf受體為slamf4(cd244、2b4)、slamf3(cd229、ly9)、slamf6(cd352、ntb-a、sf2000)、slamf5(cd84)、slamf7(cd319、cracc、cs1)、slamf1(cd150)、slamf2(cd48、fimh)、slamf8(cd353)或slamf9(cd84h1、sf2001)。在某些實(shí)施例中，所述kir-s為kir2ds1、kir2ds2、kir2ds3、kir2ds4、kir2ds5或kir3ds1。56、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域包含衍生自cd3ζ的細(xì)胞內(nèi)域。57、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域進(jìn)一步包含衍生自slam相關(guān)蛋白(sap)的細(xì)胞內(nèi)域或衍生自尤因氏肉瘤激活轉(zhuǎn)錄本-2(eat2)的細(xì)胞內(nèi)域，且其中衍生自cd3ζ的所述細(xì)胞內(nèi)域直接或經(jīng)由肽連接子連接至衍生自sap的所述細(xì)胞內(nèi)域或衍生自eat2的所述細(xì)胞內(nèi)域。在某些實(shí)施例中，衍生自cd3ζ的所述細(xì)胞內(nèi)域經(jīng)由p2a、t2a或e2a連接至衍生自sap的所述細(xì)胞內(nèi)域或衍生自eat2的所述細(xì)胞內(nèi)域。58、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car的細(xì)胞外抗原結(jié)合域包含scfv。在某些實(shí)施例中，所述car的細(xì)胞外抗原結(jié)合域結(jié)合至腫瘤抗原或其片段。59、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car包含與seq?id?no:20的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。60、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car包含與seq?id?no:86的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。61、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car包含與seq?id?no:87的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。62、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞中的所述car包含與seq?id?no:96、seq?idno:97、seq?id?no:98、seq?id?no:99、seq?id?no:100、seq?id?no:101、seq?id?no:102、seqid?no:103、seq?id?no:104、seq?id?no:105、seq?id?no:106、seq?id?no:107、seq?id?no:108、seq?id?no:109、seq?id?no:110、seq?id?no:111、seq?id?no:112、seq?id?no:113、seqid?no:114、seq?id?no:115、seq?id?no:116、seq?id?no:117、seq?id?no:118、seq?id?no:119、seq?id?no:120、seq?id?no:121、seq?id?no:122、seq?id?no:123、seq?id?no:124、seqid?no:125、seq?id?no:126、seq?id?no:127、seq?id?no:128、seq?id?no:129、seq?id?no:130、seq?id?no:131、seq?id?no:132、seq?id?no:133、seq?id?no:134、seq?id?no:135、seqid?no:136、seq?id?no:137、seq?id?no:138、seq?id?no:139、seq?id?no:140、seq?id?no:141、seq?id?no:142、seq?id?no:143、seq?id?no:144或seq?id?no:145的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。63、在某些實(shí)施例中，所述工程化免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞。64、本技術(shù)的另一方面提供了多肽。在某些實(shí)施例中，本文中的多肽包含本文提供的car。65、在某些實(shí)施例中，本文提供的多肽包含嵌合抗原受體(car)及衍生自slam相關(guān)蛋白(sap)的細(xì)胞內(nèi)域，其中所述car包含：66、(i)細(xì)胞外抗原結(jié)合域；67、(ii)跨膜域；及68、(iii)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，且69、其中所述car經(jīng)由肽連接子連接至衍生自sap的細(xì)胞內(nèi)域。70、在某些實(shí)施例中，本文提供了一種多肽，其包含嵌合抗原受體(car)及衍生自尤因氏肉瘤激活轉(zhuǎn)錄本-2(eat2)的細(xì)胞內(nèi)域，其中所述car包含：71、(i)細(xì)胞外抗原結(jié)合域；72、(ii)跨膜域；及73、(iii)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域，且74、其中所述car經(jīng)由肽連接子連接至衍生自sap的細(xì)胞內(nèi)域。75、在某些實(shí)施例中，所述car經(jīng)由p2a、t2a或e2a連接至衍生自sap的所述細(xì)胞內(nèi)域或衍生自eat2的所述細(xì)胞內(nèi)域。76、在某些實(shí)施例中，所述多肽包含與seq?id?no:86或seq?id?no:87的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。77、在某些實(shí)施例中，所述多肽包含與seq?id?no:96、seq?id?no:97、seq?id?no:98、seq?id?no:99、seq?id?no:100、seq?id?no:101、seq?id?no:102、seq?id?no:103、seq?idno:104、seq?id?no:105、seq?id?no:106、seq?id?no:107、seq?id?no:108、seq?id?no:109、seq?id?no:110、seq?id?no:111、seq?id?no:112、seq?id?no:113、seq?id?no:114、seq?idno:115、seq?id?no:116、seq?id?no:117、seq?id?no:118、seq?id?no:119、seq?id?no:120、seq?id?no:121、seq?id?no:122、seq?id?no:123、seq?id?no:124、seq?id?no:125、seq?idno:126、seq?id?no:127、seq?id?no:128、seq?id?no:129、seq?id?no:130、seq?id?no:131、seq?id?no:132、seq?id?no:133、seq?id?no:134、seq?id?no:135、seq?id?no:136、seq?idno:137、seq?id?no:138、seq?id?no:139、seq?id?no:140、seq?id?no:141、seq?id?no:142、seq?id?no:143、seq?id?no:144或seq?id?no:145的氨基酸序列至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列。78、在另一方面，本文提供了多核苷酸。在某些實(shí)施例中，本文提供的多核苷酸編碼本文提供的car或本文提供的多肽。79、在另一方面，本文提供了載體。在某些實(shí)施例中，本文提供的載體包含本文提供的多核苷酸。80、在另一方面，本文提供了醫(yī)藥組合物。在某些實(shí)施例中，本文提供的醫(yī)藥組合物包含：81、(i)本文提供的car、本文提供的工程化免疫細(xì)胞、本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸或本文提供的載體；及82、(ii)醫(yī)藥上可接受的賦形劑。83、在另一方面，本文提供了治療個(gè)體的疾病或病癥的方法。在某些實(shí)施例中，本文提供的治療個(gè)體的疾病或病癥的方法包括：向所述個(gè)體給與有效量的本文提供的工程化免疫細(xì)胞或本文提供的醫(yī)藥組合物。在某些實(shí)施例中，所述疾病或病癥為癌癥。84、在另一方面，本文提供了將免疫細(xì)胞工程化的方法。在某些實(shí)施例中，本文提供的將免疫細(xì)胞工程化的方法包括：將本文提供的多核苷酸、本文提供的載體或本文提供的多肽引入所述免疫細(xì)胞中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12