本發明涉及多肽固相合成，具體涉及一種化學衍生制備fmoc-ile-oh的方法。

背景技術：

1、多肽的固相合成通常采用氨基酸逐步偶聯的策略，所用各fmoc氨基保護的氨基酸已商業化。其中異亮氨酸采用生物發酵法制備得到。在發酵制備異亮氨酸的過程中，通常使用特定的微生物菌株進行發酵。這些菌株在代謝過程中會產生多種中間產物，其中纈氨酸（val）、正纈氨酸（nva）和異亮氨酸（ile）的合成路徑存在交叉。具體來說，異亮氨酸和纈氨酸的合成途徑在多個步驟中存在重疊，導致在合成異亮氨酸的過程中不可避免地會產生纈氨酸?和正纈氨酸。上述兩類氨基酸與異亮氨酸的結構相近，性質類似，在多肽藥物的合成中因其產生的雜質與目標產物在反相色譜中難以分離，導致多肽的純化存在困難，純化難度大，純化成本高，影響多肽合成的收率。因此，開發一種高效且便捷的純化異亮氨酸的方法，以消除因起始物料中少量的纈氨酸（val）和正纈氨酸（nva）導致產生純化難以去除的雜質，減少多肽純化次數，降低純化難度，提高多肽的純化收率是十分必要的。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種化學衍生制備fmoc-ile-oh的方法，以解決現有fmoc-ile-oh制備中制備以及純化困難、雜質多等問題。

2、為解決上述技術問題，本發明具體提供下述技術方案：

3、本發明公開了一種化學衍生制備fmoc-ile-oh的方法，包括：

4、s1：將ile衍生物先進行純化，然后加入保護基試劑，堿劑和溶劑反應并純化得到中間體；

5、s2：將中間體、催化劑和溶劑混合，通入氫化試劑反應并純化得到fmoc-ile-oh；或將中間體和脫甲酯反應試劑混合反應并純化得到fmoc-ile-oh；中間體和催化劑的使用量的質量比為1：0.15-0.8。

6、優選地，s2中催化劑為鈀碳和負載金屬碳中的至少一種，負載金屬碳由柚子皮、2,2-二吡啶基n-氧化物、1-氯-4-(三氟甲基)苯、醋酸鈀和硼氫化鈉制備得到。負載金屬碳具有較好的催化效果，可以有效促進氫化試劑的活化，使中間體和氫化試劑高效率反應，同時利用柚子皮、2,2-二吡啶基n-氧化物、1-氯-4-(三氟甲基)苯制備摻雜活性炭，并進一步負載金屬制備負載金屬碳，可以提高負載金屬碳的選擇性，從而提高中間體的轉化率、fmoc-ile-oh的收率并降低雜質含量。

7、優選地，s1中ile衍生物為h-ile-obzl和h-ile-ome中的至少一種；h-ile-ome由l-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽、2-羥基-4-甲氧基苯甲醛和甲酸銨制備得到。

8、優選地，s1中保護基試劑為fmoc-osu，ile衍生物和保護基試劑的使用量的質量比為1：1-3。

9、優選地，s1中堿劑為碳酸鈉，ile衍生物和堿劑的使用量的質量比為1：0.4-1.8。

10、優選地，s1中溶劑為四氫呋喃水溶液，四氫呋喃水溶液由四氫呋喃和水組成，四氫呋喃和水的使用量的體積比為1：0.8-1.2，ile衍生物和溶劑的用量比為1：10-30ml。

11、優選地，s2中溶劑為甲醇，中間體和甲醇的用量比為1g：4-10ml。

12、優選地，s2中氫化試劑為氫氣。

13、優選地，s2中脫甲酯反應試劑為氯化鈣溶液和氫氧化鈉溶液，氯化鈣溶液由氯化鈣、異丙醇和水組成，氯化鈣與異丙醇的用量比為1g：10-20ml，異丙醇與水的使用量的體積比為1：0.2-0.8，中間體與氯化鈣溶液的用量比為1g：50-60ml，氫氧化鈉溶液由氫氧化鈉與水組成，氫氧化鈉與水的用量比為1g：40-60ml，fmoc-ile-ome與氫氧化鈉溶液用量比為1g：8-15ml。

14、優選地，s1中反應溫度為20-30℃，tlc檢測反應。

15、優選地，s2中通入氫化試劑反應溫度為20-30℃，反應時間為3-5h，中間體和脫甲酯反應試劑混合反應溫度為20-30℃，反應時間為3-5h。

16、本發明公開了上述制備方法制備得到的fmoc-ile-oh。

17、本發明公開了一種純化h-(hmb)ile-ome的制備方法，具體為：

18、將l-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽和二氯甲烷混合，然后加入飽和碳酸氫鈉溶液，分離出有機相并干燥得到濃縮液。向濃縮液中加入2-羥基-4-甲氧基苯甲醛和三乙酰氧基硼氫化鈉，在20-30℃下tlc檢測反應，反應結束后進行淬滅萃取和濃縮得到殘樣，殘樣經過柱色譜分離得到h-(hmb)ile-ome，h-(hmb)ile-ome經過溶解和洗脫凍干得到純化h-(hmb)ile-ome。

19、優選地，l-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽與二氯甲烷的用量比為1g：20-30ml。

20、優選地，l-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽與2-羥基-4-甲氧基苯甲醛的使用量的質量比為1：0.8-1.2。

21、優選地，l-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽與三乙酰氧基硼氫化鈉的使用量的質量比為1：1-2。

22、優選地，淬滅所用溶劑為飽和碳酸氫鈉溶液，飽和碳酸氫鈉溶液由碳酸氫鈉和水組成。

23、優選地，萃取所用溶劑為二氯甲烷。

24、優選地，溶解h-(hmb)ile-ome所用溶液為乙腈溶液，乙腈溶液由乙腈和水組成，乙腈和水的使用量的體積比為1：8-10。

25、優選地，洗脫所用洗脫液由甲酸、水和乙腈組成，甲酸與水的使用量的質量比為1：300-350，乙腈與水的使用量的質量比為1：3-5。

26、本發明公開了一種h-ile-ome的制備方法，具體為：

27、將純化h-(hmb)ile-ome、鈀碳、甲酸銨和甲醇水溶液混合，在氮氣條件下，20-30℃反應10-15h，反應結束后旋蒸濾液得到殘液，殘液經過柱色譜分離得到h-ile-ome。

28、優選地，純化h-(hmb)ile-ome與鈀碳的使用量的質量比為1：0.1-0.5。

29、優選地，純化h-(hmb)ile-ome與甲酸銨的使用量的質量比為1：0.5-0.3。

30、優選地，甲醇水溶液由甲醇和水組成，甲醇和水的使用量的體積比為1：0.1-0.5。

31、優選地，純化h-(hmb)ile-ome與甲醇水溶液的用量比為1g：15-25ml。

32、本發明公開了一種化學衍生制備fmoc-ile-oh的方法，包括：

33、s1：將ile衍生物和溶劑混合，然后加入保護基試劑和堿劑，在20-30℃下tlc檢測反應，反應結束后旋蒸并分離出水相，對水相進行萃取分離出有機相，有機相經過濃縮和柱色譜分離得到中間體；

34、s2：將中間體和脫甲酯反應試劑混合，在20-30℃下反應3-5h，反應結束后加入試劑分離出水相，酸化水相至ph為5-6.5，再加入萃取劑分離得到有機相，最后進行洗滌濃縮和柱色譜分離得到fmoc-ile-oh。

35、優選地，s1中ile衍生物為h-ile-ome。

36、優選地，s1中保護基試劑為fmoc-osu，ile衍生物和保護基試劑的使用量的質量比為1：1-3。

37、優選地，s1中堿劑為碳酸鈉，ile衍生物和堿劑的使用量的質量比為1：0.4-1.8。

38、優選地，s1中溶劑為四氫呋喃水溶液，四氫呋喃水溶液由四氫呋喃和水組成，四氫呋喃和水的使用量的體積比為1：0.8-1.2，ile衍生物和溶劑的用量比為1：10-30ml。

39、優選地，s1中萃取所用試劑為二氯甲烷。

40、優選地，s2中脫甲酯反應試劑為氯化鈣溶液和氫氧化鈉溶液。

41、更優選地，氯化鈣溶液由氯化鈣、異丙醇和水組成。

42、更優選地，氯化鈣與異丙醇的用量比為1g：10-20ml，異丙醇與水的使用量的體積比為1：0.2-0.8。

43、更優選地，中間體與氯化鈣溶液的用量比為1g：50-60ml。

44、更優選地，氫氧化鈉溶液由氫氧化鈉與水組成，氫氧化鈉與水的用量比為1g：40-60ml。

45、更優選地，fmoc-ile-ome與氫氧化鈉溶液用量比為1g：8-15ml。

46、優選地，s2中試劑為乙醚。

47、優選地，s2中酸化水相所用試劑為鹽酸溶液，鹽酸溶液由鹽酸和水組成，鹽酸和水的用量比為1g：25-30ml。

48、優選地，s2中萃取劑為乙酸乙酯。

49、本發明公開了一種化學衍生制備fmoc-ile-oh的方法，包括：

50、s1：將ile衍生物溶解，用柱色譜純化，洗脫并凍干。然后將ile衍生物和溶劑混合，然后加入保護基試劑和堿劑，在20-30℃下tlc檢測反應，反應結束后旋蒸并分離出水相，對水相進行萃取分離出有機相，有機相經過濃縮和柱色譜分離得到中間體；

51、s2：將中間體和催化劑和溶劑混合，通入氫化試劑在20-30℃反應3-5h，然后收集濾液經過柱色譜分離得到fmoc-ile-oh。

52、優選地，s1中ile衍生物為h-ile-obzl。

53、優選地，s1中洗脫所用洗脫液由甲酸、水和乙腈組成，甲酸與水的使用量的質量比為1：300-350，乙腈與水的使用量的質量比為1：3-5。

54、優選地，s1中保護基試劑為fmoc-osu，ile衍生物和保護基試劑的使用量的質量比為1：1-3。

55、優選地，s1中堿劑為碳酸鈉，ile衍生物和堿劑的使用量的質量比為1：0.4-1.8。

56、優選地，s1中溶劑為四氫呋喃水溶液，四氫呋喃水溶液由四氫呋喃和水組成，四氫呋喃和水的使用量的體積比為1：0.8-1.2，ile衍生物和溶劑的用量比為1：10-30ml。

57、優選地，s1中萃取所用試劑為二氯甲烷。

58、優選地，s2中催化劑為鈀碳和負載金屬碳中的至少一種。

59、優選地，s2中中間體和催化劑的使用量的質量比為1：0.15-0.8。

60、優選地，s2中溶劑為甲醇，中間體和甲醇的用量比為1g：4-10ml。

61、優選地，s2中氫化試劑為氫氣。

62、本發明公開了一種摻雜活性炭的制備方法，具體為：

63、將柚子皮研磨成柚子皮粉，加入氫氧化鉀、2,2-二吡啶基n-氧化物和1-氯-4-(三氟甲基)苯混合均勻，在氮氣氣氛下，以4-6℃/min的升溫速率，750-850℃碳化1.5-3h得到樣品，經酸洗和水洗，最后干燥得到摻雜活性炭。

64、優選地，柚子皮粉與氫氧化鉀的使用量的質量比為1：1-2。

65、優選地，柚子皮粉與2,2-二吡啶基n-氧化物的使用量的質量比為1：0.3-0.7。

66、優選地，2,2-二吡啶基n-氧化物與1-氯-4-(三氟甲基)苯的使用量的質量比為1：0.3-2。

67、本發明公開了一種負載金屬碳的制備方法，具體為：

68、將摻雜活性炭加入醋酸鈀溶液中，在20-30℃攪拌3-5h，然后分離出固體，向固體中加入混合溶液和硼氫化鈉，在20-30℃再攪拌3-5h，分離出固體，洗滌并干燥得到負載金屬碳。

69、優選地，醋酸鈀溶液由醋酸鈀和甲苯組成。

70、優選地，醋酸鈀和甲苯的用量比為1g：350-450ml。

71、優選地，摻雜活性炭與醋酸鈀溶液的用量比為1g：5-10ml。

72、優選地，混合溶液由甲苯和乙醇組成，甲苯和乙醇的使用量的體積比為1：0.2-0.8。

73、優選地，摻雜活性炭與混合溶液的用量比為1g：6-10ml。

74、優選地，摻雜活性炭與硼氫化鈉的使用量的質量比為1：0.02-0.06。

75、優選地，洗滌所用試劑為乙醇。

76、更優選地，本發明在制備負載金屬碳的過程中，在使用2,2-二吡啶基n-氧化物與1-氯-4-(三氟甲基)苯制備摻雜活性炭的基礎上，還可以使用環糊精衍生物，將環糊精衍生物與摻雜活性炭協同使用制備負載金屬碳，可以進一步提高負載金屬碳的活性和選擇性，提高中間體和氫化試劑的反應效率，最后使得中間體的轉化率和fmoc-ile-oh的收率得到提高，雜質含量也得到有效降低。

77、優選地，摻雜活性炭與環糊精衍生物的使用量的質量比為1：0.02-0.5。

78、本發明公開了一種環糊精衍生物的制備方法，具體為：

79、將β-環糊精、(氯磺酰基)乙酸乙酯和四丁基溴化銨加入水中，在20-30℃反應10-15h，然后滴入氫氧化鈉溶液再繼續反應40-50min，向反應濾液加入氯化銨調節ph至7.5-8.5，在0-5℃靜置10-15h后分離得到粗產物，粗產物經過洗滌、重結晶和干燥得到環糊精衍生物。

80、優選地，β-環糊精與(氯磺酰基)乙酸乙酯的使用量的質量比為1：0.2-0.3。

81、優選地，β-環糊精與四丁基溴化銨的使用量的質量比為1：0.005-0.01。

82、優選地，β-環糊精與水的用量比為1g：20-30ml。

83、優選地，氫氧化鈉溶液由氫氧化鈉和水組成，氫氧化鈉與水的用量比為1g：8-15ml。

84、優選地，β-環糊精與氫氧化鈉溶液的用量比為1g：2-5ml。

85、本發明與現有技術相比較具有如下有益效果：

86、本發明提出了一種化學衍生制備fmoc-ile-oh的方法，將ile衍生物先進行純化，然后加入保護基試劑，堿劑和溶劑反應并純化得到中間體；接著將中間體、催化劑和溶劑混合，通入氫化試劑反應并純化得到fmoc-ile-oh；或將中間體和脫甲酯反應試劑混合反應并純化得到fmoc-ile-oh。本發明制備方法可以潛在避免fmoc-ile-oh中存在微量的fmoc-val-oh與fmoc-nva-oh，而引起的多肽合成中的問題，且本發明制備方法中間體的轉化率以及fmoc-ile-oh的收率較高，在含ile的多肽藥物合成中具有廣泛的應用前景。