本發明屬于生物化工領域，具體涉及一種高效利用木質纖維素水解液發酵生產乳酸的方法。

背景技術：

1、乳酸是三大有機酸之一，也是人類日常生活中應用到的最普遍的有機酸之一。乳酸是重要的生物化工產品，在食品、飲料、日用品、醫藥、石油化工、煙草、輕紡等領域有廣泛的應用；也可作為酸味劑、調味劑、抑菌劑和防腐劑等。乳酸的聚合物是具有生物可降解和生物相容性的高分子材料，可以用于制作一次性餐具、購物袋、塑料袋、農用薄膜、衛生用品等，從而緩解白色污染帶來的環境壓力，還可以制備骨科固定材料、藥物緩釋材料、手術縫合線等現代醫用材料。因此，乳酸具有廣闊的市場應用和需求。

2、目前乳酸的工業生產主要是生物發酵法，以玉米、木薯、土豆等淀粉基原料和甘蔗、甜菜等糖基原料為主。這種生產方式不僅原料價格高昂，而且存在“與人爭糧、與糧爭地”?的問題。而廉價易得的農林廢棄物，如玉米秸稈、甘蔗渣、小麥秸稈等木質纖維素則是很好的替代性原料。木質纖維素是一種非均質聚合物，主要由纖維素、半纖維素、木質素組成。木質素與纖維素、半纖維素直接交聯，并與碳水化合物發生酯化阿魏酸交聯，形成碳水化合物-阿魏酸木質素結構，還通過范德華力和氫鍵附著在纖維素表面。這進一步加劇了木質纖維素細胞壁的復雜性和抗降解性，嚴重阻礙了其生物轉化。

3、預處理是木質纖維素利用的第一步也是關鍵的一步，主要分為物理法、化學法、生物法和物理化學法。不同方法預處理木質纖維素過程中，難以避免都會產生抑制物，抑制物往往不止一種，多種抑制物的存在對發酵還有著協同抑制作用。酸預處理、堿預處理和蒸汽爆破預處理是使用較為廣泛的預處理方法。酸法預處理過程中，半纖維素在酸的作用下生產戊糖和己糖，戊糖和己糖脫水產生糠醛和5-羥甲基糠醛。堿法預處理主要是由堿進攻木質素產生酚類抑制物，根據苯環上r支鏈官能團類型，將酚類物質分為以松柏醛、對羥基苯甲醛為代表的酚醛；以松伯醇、芥子醇、對羥基苯甲醇為代表的酚醇等。蒸汽爆破預處理過程伴隨著半纖維素和木質素的降解產生一些酚類和糠醛類物質，使得預處理的利用率較低。

4、糠醛和5-羥甲基糠醛等呋喃類化合物主要通過破壞細胞膜的通透性，抑制細胞內參與微生物代謝的關鍵酶活性抑制菌體生長；使微生物體內大量的翻譯活動衰減，從而使微生物生理狀態退化；糠醛還能誘導微生物細胞內的活性氧積累，導致線粒體、液泡膜和核染色質的損傷，甚至引發細胞死亡。呋喃類的抑制機制涉及微生物細胞結構的完整性、合成和代謝過程等方面，嚴重影響了生物轉化率。酚類物質的抑制作用主要體現在酚類支鏈上的羥基具有吸附蛋白質的能力，與酶結合使其沉淀、失活；導致基因突變，破壞細胞的完整性；破壞細胞的抗氧化防御系統。

5、木質纖維素預處理抑制物對微生物有明顯的抑制作用，是乳酸發酵生產的主要瓶頸之一。為降低抑制物的負面影響，近年來研究者在發酵工藝的改進上有一定研究，比如加入脫毒步驟。吸附脫毒是比較常見的脫毒方法，主要利用吸附樹脂和交聯聚乙烯亞胺選擇性地吸附預處理液中的呋喃和酚類物質。deng（ind?crops?prod,?2018,?112:?681-690）等利用pei和聚二烯丙基二甲基氯化銨處理稀氨預處理后的甘蔗渣水解液，能夠去除43%的有機酸、73%的總酚類化合物。lópez-linares等（enzyme?microb?technol,?2020,?135:109490）利用離子交換樹脂吸附處理硫酸酸解菜籽秸稈的抑制物，酚類、呋喃醛類化合物降到了比較低的水平。物理吸附法雖然去除抑制物效果不錯，但是樹脂等吸附劑的活化、再生都需要耗費大量水和化學物質，環保壓力大，成本高。此外，吸附法往往把樹脂填柱，以利于回收利用，增加了設備和場地投入。

6、persson等（j?agric?food?chem,?2002,?50(19):5318-5325.）研究了氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氨水4種堿的脫毒效果，結果該抑制物的去除率約為40%。haq等（jchem?technol?biotechnol,2018,?93(10):?3011-3017）使用氫氧化鈣進行脫毒，通過提高反應溫度至80?℃，使酚類物質的去除率提高至60%。xie等（bioresour?technol,?2015,186:?106-113.）使用20種氨基酸處理木質纖維素預處理液，發現半胱氨酸效果最好，96%的5-羥甲基糠醛消耗掉，但是其它抑制物的去除效果不明顯。還原劑如連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽和硫代硫醇也已經應用于木質纖維素預處理液的脫毒過程。還原劑雖然可以在溫和條件下進行原位脫毒，但是效果不佳，需要組合堿脫毒等其他脫毒方法。

7、目前的木質纖維素基乳酸發酵工藝，部分不經脫毒步驟直接使用含有大量抑制物的水解液進行發酵，導致乳酸收率低；而采用物理吸附脫毒法的發酵工藝因投入額外設備和繁瑣的操作流程等導致生產效率低；采用化學脫毒法的發酵工藝又往往因脫毒不完全或者脫毒劑殘留而引入新的抑制物。因此，仍有必要發展一種包含無需額外設備投入的原位脫毒方法的發酵工藝，助力乳酸的高效發酵生產。

技術實現思路

1、本發明的目的是針對現有技術的不足，一種高效利用木質纖維素預處理液生產乳酸的方法。

2、為了實現上述目的，采用如下技術方案：

3、一種高效利用木質纖維預處理液生產乳酸的方法，包括如下步驟：

4、（1）將木質纖維素預處理液裝入發酵罐，調節ph后加入脫毒劑攪拌均勻，加熱并保溫額定時間；

5、（2）分批加入氧化劑，直至系統中無氣泡產生；

6、（3）加熱到一定溫度，調節ph，加入纖維素酶進行水解糖化，水解糖化過程中用堿調節ph，得到脫毒后的木質纖維素水解液；

7、（4）將凝結芽孢桿菌接種于斜面培養基上獲得單菌落，將單菌落接種于種子培養基中獲得種子液；

8、（5）將種子液接種于發酵培養基中，保持一定溫度，通入空氣進行發酵；發酵過程中流加堿液維持發酵體系的ph為6。

9、進一步地，步驟（1）中所述木質纖維素預處理液的原料為玉米秸稈、甘蔗渣、水稻秸稈、煙葉秸稈、筍殼中的任意一種。

10、進一步地，步驟（1）中所述脫毒劑為雙氧水，濃度為0.5%~1.5%，脫毒劑的用量為木質纖維素預處理液原料質量的0.1%~1%；所述調節ph為1~4，所述加熱的溫度為30~40?℃；保溫額定時間為0.5~2?h。

11、進一步地，步驟（2）中所述氧化劑為二氧化錳，用量為木質纖維素預處理液原料質量的0.01%~0.2%。

12、進一步地，步驟（3）中所述加熱的溫度為45~55?℃，所述ph為4.5~6；所述纖維素酶的添加量為每g木質纖維素原料添加5~20?fpu，所述水解糖化時間為36~48?h。

13、進一步地，步驟（3）和步驟（5）中所述堿液為氨水、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鈉中的任意一種。

14、進一步地，步驟（4）中所述斜面培養基組分為胰蛋白胨5?g/l，酵母膏15?g/l，磷酸氫二鉀3?g/l，葡萄糖2?g/l，木糖1?g/l，瓊脂20?g/l，調節ph為7~8。

15、進一步地，步驟（5）中所述種子培養基的組分為酵母浸粉20?g/l，七水合硫酸鎂0.5?g/l，磷酸氫二鉀1?g/l，葡萄糖45g/l，木糖15?g/l，一水合硫酸錳0.015?g/l，碳酸鈣20g/l。

16、進一步地，步驟（5）中所述發酵培養基包含脫毒后的木質纖維素水解液和酵母浸粉，酵母浸粉的用量為每l木質素預處理液使用10?g酵母浸粉。

17、進一步地，步驟（5）中所述發酵溫度為45~55?℃，通人空氣的時間為1~3?h，通氣量為1~3?vvm。

18、本發明的有益效果為：

19、本發明以雙氧水為初步脫毒劑具有以下優勢：

20、（1）脫毒步驟和糖化步驟可以在同一反應器內，操作簡便。

21、（2）雙氧水氧化木質纖維素中的糠醛、5-羥甲基糠醛、香草醛等醛類物質為酸，大大降低了抑制物的毒性；并且氧化酸溶木質素中的酚類物質為醌，減小了其對微生物的細胞毒性。同時雙氧水的還原產物為水，清潔無污染。

22、（3）氧化劑二氧化錳可以快速去除溶液中的雙氧水，防止殘留的雙氧水對后續糖化和發酵步驟產生不良影響；同時二氧化錳自身被還原為二價錳離子，它是許多酶的輔助因子，參與催化各種生物化學反應，可促進乳酸菌的生長和代謝，提高生產效率。

23、（4）雙氧水被氧化釋放出氧氣，可作為溶解氧被兼性厭氧的乳酸菌利用；氧溶解飽和后，剩余的氧氣通過鼓泡器排出，可作為雙氧水是否分解完畢的判斷標準。

24、（5）本工藝可原位脫毒，操作便利，條件溫和，脫毒劑對后續糖化和發酵步驟無不利影響，并且還原產生的錳離子還有助于乳酸發酵生產。

25、木質纖維素乳酸發酵工藝具有以下優勢：

26、（1）斜面培養基和種子培養基中加入木糖，有利于快速激活乳酸菌的木糖代謝途徑，提高發酵效率。

27、（2）種子液中的碳源葡萄糖和木糖的比例為3:1，與木質纖維素水解液中的碳源比例接近，利于乳酸菌更快適應發酵液環境。

28、（3）發酵培養基無需加入額外的無機鹽，并且含有脫毒步驟中得到的微量二價錳離子，有利于乳酸菌的生長代謝和發酵生產。

29、（4）發酵溫度高，其它雜菌無法存活，可執行開放式發酵。

30、（5）種子液接種初期通入適量空氣，利于兼性厭氧的乳酸菌快速生長。

31、綜上所述，本發明解決了木質纖維素基乳酸生產過程中脫毒不徹底、脫毒劑殘留的問題。以二氧化錳為氧化劑在酸性條件下氧化雙氧水，其自身被還原為利于乳酸菌生長的二價錳離子；斜面和種子培養基中加入與糖化液中的碳源比例接近的葡萄糖和木糖，利于乳酸菌盡快適應發酵環境。接種后通入適量空氣，利于兼性厭氧的乳酸菌快速生長，提高了發酵生產效率。