本發(fā)明涉及發(fā)酵，特別涉及一種用于表達(dá)牛乳鐵蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

1、乳鐵蛋白是一種主要存在于人乳中的天然抗菌糖蛋白，因其特異性的鐵離子結(jié)合能力，使其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有較強(qiáng)的殺菌、抑菌能力。并且乳鐵蛋白還具有抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種作用。因此，乳鐵蛋白被廣泛用于奶粉、食品和藥品等多種領(lǐng)域。美國(guó)fda、日本、韓國(guó)等目前均允許將乳鐵蛋白作為食品添加劑應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)、功能性食品中，我國(guó)在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)gb2760-19966》2004年增補(bǔ)品種中允許在嬰兒配方奶粉中添加乳鐵蛋白。

2、研究發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白與人乳鐵蛋白具有極其相似的生物活性，但從牛乳中分離制備牛乳鐵蛋白的分離難度大、成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于表達(dá)牛乳鐵蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，用于克服現(xiàn)有技術(shù)中牛乳鐵蛋白制備難度大、成本高的問(wèn)題。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種用于表達(dá)牛乳鐵蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括以下組分：酵母提取物10～20g/l、蛋白胨20～30g/l、甘油或葡萄糖10～20g/l、不含氨基酸的酵母氮基(ynb)12～15g/l、磷酸氫二鉀4～6g/l、磷酸二氫鉀2～3g/l、生物素0.0002～0.0005g/l、氨基酸4～46g/l、亞鐵鹽2～5g/l、糖類物質(zhì)5～10g/l和糖類物質(zhì)衍生物5～10g/l。

3、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明用于表達(dá)牛乳鐵蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有4～46g/l的氨基酸、2～5g/l的亞鐵鹽、5～10g/l的糖類物質(zhì)和5～10g/l的糖類物質(zhì)衍生物，共同起到提升牛乳鐵蛋白表達(dá)量的效果。并且，本發(fā)明作為碳源的甘油或葡萄糖初始濃度較低，減輕了底物的濃度抑制，提高了菌體生長(zhǎng)速度，縮短菌體生長(zhǎng)延滯期，從而縮短生長(zhǎng)周期。此外，發(fā)酵培養(yǎng)基酵中的酵母提取物和蛋白胨可以提高分泌蛋白的穩(wěn)定性，防止或減少分泌蛋白被降解，發(fā)酵培養(yǎng)基酵中的生物素在菌體代謝過(guò)程中作為多種酶的輔基起作用，保證了菌體內(nèi)酶系的活性。

4、進(jìn)一步地，氨基酸包括l-組氨酸，l-組氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為4～6g/l。

5、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中限定了培養(yǎng)基中的氨基酸為含量為4～6g/l的l-組氨酸，由于本發(fā)明中的牛乳鐵蛋白使用組氨酸為篩選標(biāo)記的表達(dá)系統(tǒng)，因此培養(yǎng)基中加入l-組氨酸可以促進(jìn)發(fā)酵后期牛乳鐵蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

6、進(jìn)一步地，氨基酸還包括谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或丙氨酸中的1～2種；

7、谷氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為5～10g/l；

8、天冬氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為15～20g/l；

9、亮氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為5～15g/l；

10、丙氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為10～20g/l。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中限定了氨基酸還包括谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或丙氨酸中的1～2種，培養(yǎng)基中加入該氨基酸后與l-組氨酸具有協(xié)同作用，可以進(jìn)一步促進(jìn)菌體合成牛乳鐵蛋白。

12、進(jìn)一步地，糖類物質(zhì)包括單糖；所述單糖包括甘露糖和/或半乳糖；和/或，亞鐵鹽為硫酸亞鐵。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案在培養(yǎng)基中加入了甘露糖和/或半乳糖，以及硫酸亞鐵。上述特定種類的糖類物質(zhì)可以提高牛乳鐵蛋白的合成效率，提升牛乳鐵蛋白表達(dá)量。并且，牛乳鐵蛋白是一種含鐵離子的糖蛋白，硫酸亞鐵中的亞鐵離子既可以在合成牛乳鐵蛋白時(shí)發(fā)揮作用，還能提高發(fā)酵菌體的酶活性，參與菌體的代謝反應(yīng)。

14、糖類物質(zhì)衍生物為n-乙酰葡萄糖胺；n-乙酰葡萄糖胺在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為5～10g/l。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中限定了糖類物質(zhì)衍生物的種類和含量，培養(yǎng)基中適量的n-乙酰葡萄糖胺與培養(yǎng)基中的其他物質(zhì)配合，可以促進(jìn)牛乳鐵蛋白的合成，從而提高牛乳鐵蛋白的表達(dá)量。

16、第二方面，本發(fā)明提供一種生成牛乳鐵蛋白的發(fā)酵方法，包括以下步驟：

17、將含有牛乳鐵蛋白編碼基因的重組畢赤酵母菌種子液接種到上述發(fā)酵培養(yǎng)基中開(kāi)始發(fā)酵；

18、培養(yǎng)30～35h小時(shí)后，流加菌體培養(yǎng)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基a，取樣檢測(cè)發(fā)酵液的od600值，當(dāng)od600達(dá)到150～200時(shí)，停止流加培養(yǎng)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基a；所述培養(yǎng)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基a包括甘油500～600g/l、酵母提取物5～8g/l；

19、將溫度降至22～24℃，流加誘導(dǎo)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基b，開(kāi)始誘導(dǎo)重組畢赤酵母菌表達(dá)牛乳鐵蛋白；所述誘導(dǎo)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基b包括甲醇0.5～1l/l、蛋白胨為5～10g/l；誘導(dǎo)培養(yǎng)35～40h。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)控制補(bǔ)料培養(yǎng)基中的碳源氮源比例，有效提升菌體生長(zhǎng)速度以及目的蛋白的表達(dá)水平，并且，本發(fā)明中碳源氮源合并補(bǔ)料，給發(fā)酵過(guò)程人員操作帶來(lái)較大的便利性，使其能準(zhǔn)確控制補(bǔ)料培養(yǎng)基的添加量。

21、進(jìn)一步地，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程使用氨水控制發(fā)酵液的ph為5～6；菌體培養(yǎng)階段維持ph為5.5～6，誘導(dǎo)階段維持ph為5～5.5。

22、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案在菌體培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段分別維持不同的ph值，有利于菌體培養(yǎng)階段的生長(zhǎng)繁殖，以及誘導(dǎo)階段的蛋白表達(dá)。

23、進(jìn)一步地，以發(fā)酵液體積計(jì)，所述培養(yǎng)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基a的流加速率為20～40g/l/h；

24、所述誘導(dǎo)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基b第0～5h的流加速率為1～3ml/l/h，5h后的流加速率為4～6ml/l/h。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中限定了培養(yǎng)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基a和誘導(dǎo)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基b的流加速率，在上述特定的流加速率流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，可以合理給發(fā)酵菌體提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖和目的蛋白的表達(dá)。

26、進(jìn)一步地，重組畢赤酵母菌為將牛乳鐵蛋白基因、paox1啟動(dòng)子與載體ppic9k連接后轉(zhuǎn)化進(jìn)入gs115型畢赤酵母中所得；

27、牛乳鐵蛋白以組氨酸為篩選標(biāo)記。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案限定了牛乳鐵蛋白的篩選標(biāo)記，以組氨酸為篩選標(biāo)記的牛乳鐵蛋白更適于上述發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵方法，表達(dá)量更高，并且有利于后續(xù)的蛋白純化。

技術(shù)特征：

1.一種用于表達(dá)牛乳鐵蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，包括以下組分：酵母提取物10～20g/l、蛋白胨20～30g/l、甘油或葡萄糖10～20g/l、不含氨基酸的酵母氮基12～15g/l、磷酸氫二鉀4～6g/l、磷酸二氫鉀2～3g/l、生物素0.0002～0.0005g/l、氨基酸4～46g/l、亞鐵鹽2～5g/l、糖類物質(zhì)5～10g/l和糖類物質(zhì)衍生物5～10g/l。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸包括l-組氨酸，所述l-組氨酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為4～6g/l。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸還包括谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸或丙氨酸中的1～2種；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述糖類物質(zhì)包括單糖；所述單糖包括甘露糖和/或半乳糖；和/或，所述亞鐵鹽為硫酸亞鐵。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述糖類物質(zhì)衍生物為n-乙酰葡萄糖胺；所述n-乙酰葡萄糖胺在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為5～10g/l。

6.一種生成牛乳鐵蛋白的發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程使用氨水控制發(fā)酵液的ph為5～6；菌體培養(yǎng)階段維持ph為5.5～6，誘導(dǎo)階段維持ph為5～5.5。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其特征在于，以發(fā)酵液體積計(jì)，所述培養(yǎng)階段補(bǔ)料培養(yǎng)基a的流加速率為20～40g/l/h；

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其特征在于，所述重組畢赤酵母菌為將牛乳鐵蛋白基因、paox1啟動(dòng)子與載體ppic9k連接后轉(zhuǎn)化進(jìn)入gs115型畢赤酵母中所得；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)一種用于表達(dá)牛乳鐵蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。該發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分：酵母提取物10～20g/L、蛋白胨20～30g/L、甘油或葡萄糖10～20g/L、不含氨基酸的酵母氮基12～15g/L、磷酸氫二鉀4～6g/L、磷酸二氫鉀2～3g/L、生物素0.0002～0.0005g/L、氨基酸4～46g/L、亞鐵鹽2～5g/L、糖類物質(zhì)5～10g/L和糖類物質(zhì)衍生物5～10g/L。使用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基能夠在滿足菌體的生長(zhǎng)代謝需求的同時(shí)提高牛乳鐵蛋白的表達(dá)量。

技術(shù)研發(fā)人員：朱理平,徐良平,侯志遠(yuǎn),王魯明
受保護(hù)的技術(shù)使用者：諸城市浩天藥業(yè)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24