本發明涉及體外疾病模型和高通量篩選方法領域。

背景技術：

1、人肺中的氣道上皮充當針對外部病原體的物理屏障和免疫屏障，保護底層組織免受感染。在許多呼吸道疾病中，氣道上皮的完整性受到損害，而在臨床環境以外的人肺中研究這一過程則非常困難。人肺感染流感病毒通常會引起肺泡上皮的慢性損傷，所述肺泡上皮維持適當的肺泡功能，如氣體交換。肺泡細胞之間的緊密連接形成能夠在損傷后再生的穩固上皮層。

2、雖然動物模型在急性肺損傷研究中得到廣泛應用，但由于不同物種在肺解剖結構和免疫反應方面存在差異，這些模型面臨挑戰，從而限制了研究結果的轉化價值。倫理問題也持續困擾著活動物在藥物研究中的使用。因此，可靠且生理相關的人肺泡上皮體外模型成為快速藥物發現的重要工具，支持著對呼吸道疾病病因和治療的臨床前研究。

3、為了解驅動疾病發生和進展的機制，建立一種在臨床環境之外能模擬人體生理狀況的預測性體外模型系統非常重要。使用人肺上皮細胞的浸沒培養物作為初始體外模型在復制人肺生理學方面能力有限。引入允許氣-液或液-液界面的transwell系統，能夠更好地模擬人呼吸道環境。然而，由于培養條件的表型差異，使用永生化細胞系，如來源于肺癌的a549細胞，無法再現關鍵的生理特征。此外，非患病者的初代肺泡細胞供應有限且成本高昂。

4、鑒于這些限制，需要一種可擴展且可再現的體外模型，所述模型可以模擬人肺生理學并且為篩選潛在治療干預提供有效平臺。本發明解決了這種需求。

技術實現思路

1、本發明旨在提供一種被優化用于培養初代人肺泡上皮細胞(aec)的高通量體外肺損傷模型。這一模型有助于研究高致病性流感病毒感染所涉及的機制，并且增強藥物篩選能力，同時減少對供體細胞的需求并最大限度地縮短所需時間。

2、根據本發明的一個方面，本發明提供一種高通量體外肺損傷模型系統。此系統提供一種更具預測性且可擴展的人肺泡上皮體外模型，從而促進疾病機制的研究和治療干預的開發。所述系統被用于篩選治療呼吸道感染性疾病的多種候選化合物。所述系統包括96孔系統中的多個transwell細胞培養小室(transwell?insert)、用于將多種候選化合物施加于受感染的肺泡上皮細胞的裝置以及用于測量受感染的肺泡上皮細胞中的肺泡液體清除率和肺泡蛋白質滲透性的設備。每個transwell細胞培養小室含有初代人肺泡上皮細胞形成的單層，并且所述初代人肺泡上皮細胞經受一種或多種呼吸道病原體感染。肺泡上皮細胞的緊密連接完整性是通過測量經上皮電阻(teer)監測。teer維持至少2000ω/cm2。

3、在24小時的培育期后，測量肺泡液體清除率(afc)隨頂室中存在的熒光標記的葡聚糖濃度的變化。使用分子量為70kda的熒光標記的葡聚糖測量肺泡滲透性(app)。使用熒光標記的葡聚糖追蹤從transwell的頂室到基底外側室的單向通量。

4、根據本發明的一個方面，呼吸道感染性疾病包括病毒性呼吸道感染。

5、根據本發明的一個方面，所述一種或多種呼吸道病原體包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、冠狀病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒(mers-cov)、人副流感病毒(hpiv)、人間質肺炎病毒(hmpv)、腺病毒、鼻病毒和腸道病毒。

6、根據本發明的一個方面，所述初代人肺泡上皮細胞是從非惡性肺組織分離。

7、根據本發明的一個方面，所述初代人肺泡上皮細胞是以每孔1×104至1×105個細胞的密度接種于所述transwell細胞培養小室中。

8、根據本發明的一個方面，所述多種候選化合物包括來源于人間充質基質細胞的納米大小的細胞外囊泡(ev)。

9、根據本發明的一個方面，本發明提供一種用于高通量篩選治療呼吸道感染性疾病的多種候選化合物的方法，所述方法包括：從非惡性肺組織分離初代人肺泡上皮細胞；在96孔transwell系統中的多個transwell細胞培養小室中接種并培養所述初代人肺泡上皮細胞；用一種或多種呼吸道病原體感染所述初代人肺泡上皮細胞；用多種候選化合物治療受感染的初代人肺泡上皮細胞；以及評估所述多種候選化合物對包含afc和app的至少一個生理參數的影響以篩選治療化合物。

10、根據本發明的一個方面，呼吸道感染性疾病包括病毒性呼吸道感染。

11、根據本發明的一個方面，所述一種或多種呼吸道病原體包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、冠狀病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒(mers-cov)、人副流感病毒(hpiv)、人間質肺炎病毒(hmpv)、腺病毒、鼻病毒和腸道病毒。

12、根據本發明的一個方面，所述初代人肺泡上皮細胞是從非惡性肺組織分離。

13、根據本發明的一個方面，所述多種候選化合物包括來源于人間充質基質細胞的納米大小的ev。

14、根據本發明的一個方面，測量治療化合物對至少一個生理參數的影響的步驟包括測量炎性細胞因子的表達以評價候選化合物的治療作用。

15、根據本發明的一個方面，測量治療化合物對至少一個生理參數的影響的步驟包括監測一種或多種離子轉運蛋白的活性，所述一種或多種離子轉運蛋白選自由以下組成的組：上皮鈉通道(enac)、cftr通道和na/k-atp酶泵。

16、根據本發明的一個方面，所述初代人肺泡上皮細胞是在所述96孔transwell系統內的液-液界面中培養。

17、根據本發明的一個方面，所述初代人肺泡上皮細胞是以每孔1×104至1×105個細胞的密度接種。

18、根據本發明的一個方面，所述初代人肺泡上皮細胞被所述一種或多種呼吸道病原體感染，感染復數(moi)在0.1至3的范圍內。

19、根據本發明的一個方面，所述多種候選化合物是以每孔1×107至1×109個ev粒子施用。

20、根據本發明的另一方面，所述方法包括產生在單層中顯示緊密連接形成的體外肺泡上皮，從而以高通量形式(96孔)建立體外肺損傷模型。

21、根據本發明的另一方面，所述方法包括研究流感病毒感染所涉及的機制以及篩選用于治療的有效藥物。

22、本發明利用從接種到96孔形式的transwell系統中的從人肺組織分離的細胞的初代培養物，增加了體外急性肺損傷模型的生理相關性，并且允許快速且高通量篩選和鑒別患者特異性藥物治療。

23、這種高通量體外肺損傷模型有助于開發患者特異性的療法，因為初代人肺細胞來源于特定供體。這使得可以根據體外肺損傷模型中的表型藥物篩選結果進行微調，從而定制呼吸道疾病的治療方案，便于轉化為臨床應用，最大限度地提高成功治療的機會。

24、此外，高通量形式96孔transwell系統允許同時篩選較大規模的藥物/干預候選物。這種96孔形式允許在每一個transwell中利用最少量的初代人肺細胞，由此使篩選能力最大化。

技術特征：

1.一種高通量體外肺損傷模型系統，用于篩選治療呼吸道感染性疾病的多種候選化合物，其特征在于，其中所述系統包含：

2.根據權利要求1所述的高通量體外肺損傷模型系統，其中所述呼吸道感染性疾病包含病毒性呼吸道感染。

3.根據權利要求1所述的高通量體外肺損傷模型系統，其中所述一種或多種呼吸道病原體包含流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、冠狀病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒(mers-cov)、人副流感病毒(hpiv)、人間質肺炎病毒(hmpv)、腺病毒、鼻病毒和腸道病毒。

4.根據權利要求1所述的高通量體外肺損傷模型系統，其中所述初代人肺泡上皮細胞是從非惡性肺組織分離的。

5.根據權利要求1所述的高通量體外肺損傷模型系統，其中所述初代人肺泡上皮細胞是以每孔1×104至1×105個細胞的密度接種于所述transwell細胞培養小室的頂室中。

6.根據權利要求1所述的高通量體外肺損傷模型系統，其中所述多種候選化合物包含來源于人間充質基質細胞的納米大小的細胞外囊泡。

7.一種用于高通量篩選治療呼吸道感染性疾病的多種候選化合物的方法，其特征在于，其中所述方法包含：

8.根據權利要求7所述的方法，其中所述呼吸道感染性疾病包含病毒性呼吸道感染。

9.根據權利要求7所述的方法，其中所述一種或多種呼吸道病原體包含流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、冠狀病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒(mers-cov)、人副流感病毒(hpiv)、人間質肺炎病毒(hmpv)、腺病毒、鼻病毒和腸道病毒。

10.根據權利要求7所述的方法，其中所述初代人肺泡上皮細胞是從非惡性肺組織分離的。

11.根據權利要求7所述的方法，其中所述多種候選化合物包含來源于人間充質基質細胞的納米大小的細胞外囊泡。

12.根據權利要求7所述的方法，其中測量治療化合物對至少一個生理參數的影響的步驟包含測量炎性細胞因子的表達。

13.根據權利要求7所述的方法，其中測量治療化合物對至少一個生理參數的影響的步驟包含監測一種或多種離子轉運蛋白的活性，所述一種或多種離子轉運蛋白選自由以下組成的組：上皮鈉通道(enac)、cftr通道和na/k-atp酶泵。

14.根據權利要求7所述的方法，其中所述初代人肺泡上皮細胞是在所述96孔transwell系統內的液-液界面中培養。

15.根據權利要求7所述的方法，其中所述初代人肺泡上皮細胞是以每孔1×104至1×105個細胞的密度接種。

16.根據權利要求7所述的方法，其中所述初代人肺泡上皮細胞被所述一種或多種呼吸道病原體感染，感染復數(moi)在0.1至3的范圍內。

17.根據權利要求7所述的方法，其中所述多種候選化合物是以每孔1×107至1×109個細胞外囊泡粒子的密度施用。

技術總結
本發明涉及一種用于研究針對嚴重呼吸道病原體的治療干預的生理上相關的高通量體外人肺損傷模型。在本模型中，人肺泡上皮細胞感染高致病性甲型流感病毒A/HK/483/97(H5N1)，隨后在感染后24小時，用細胞外囊泡(EV)治療。24小時后，甲型流感H5N1感染明顯降低肺泡液體清除率(AFC)并增加肺泡滲透性(APP)。施用治療性EV將在體外于受感染上皮細胞中恢復AFC和APP，減少失調的促炎性細胞因子的表達，并增強受病毒抑制的肺泡鈉和氯轉運蛋白。這些發現證實了EV在減輕由甲型流感H5N1引起的上皮損傷方面的潛在治療功效，并且強調了高通量肺模型在篩選呼吸道疾病治療中的適用性。

技術研發人員：陳志偉,馬寶怡,程曉霞
受保護的技術使用者：免疫與感染研究中心有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28