本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種偽狂犬病毒gd重組蛋白、亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、偽狂犬病病毒(prv)是偽狂犬病的病原體，1902年由匈牙利獸醫(yī)aladáraujeszky首次證實(shí)，因此偽狂犬病也稱為aujeszky's病。prv的天然宿主是豬，但它也可以感染各種哺乳動(dòng)物，如牛、羊、狗、貓和小鼠。偽狂犬病是一種高度傳染性疾病，可通過唾液、鼻腔分泌物和氣溶膠傳播。感染prv仔豬的臨床癥狀是咳嗽、打噴嚏、發(fā)燒、便秘、共濟(jì)失調(diào)和流涎，導(dǎo)致死亡率很高，尤其是感染prv不到1個(gè)月大的仔豬，死亡率接近100％。母豬的臨床癥狀為流產(chǎn)、死產(chǎn)或木乃伊胎。一些非自然宿主，如小鼠，感染prv的死亡率也接近100％。

2、prv的病毒粒子直徑約為100-150nm，從內(nèi)到外包括核心、衣殼、外殼和包膜。核心和衣殼形成核衣殼，線性雙鏈dna(dsdna)基因組被二十面體衣殼包裹。偽狂犬病病毒基因組的平均gc含量約為74％，長(zhǎng)度約為150kb，具有至少70個(gè)開放閱讀框(orf)，編碼100多種病毒蛋白，成熟病毒粒子含有約50種病毒結(jié)構(gòu)蛋白。prv感染通過病毒顆粒包膜上的糖蛋白(如gb和gc)與細(xì)胞表面的乙酰肝素酶蛋白聚糖結(jié)合來完成吸附過程。gd與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合輔助病毒侵入細(xì)胞。細(xì)胞膜上已知的prv受體包括nectin-1、hvem和3-o-硫酸乙酰肝素。病毒包膜和細(xì)胞膜的融合過程由gb、gh和gl介導(dǎo)。研究表明，幾種prv亞單位疫苗，如gd和gb，在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中作為prv的保護(hù)性抗原表達(dá)，具有很高的安全性，可用于不適合接種活疫苗的妊娠母豬等特殊情況。亞單位疫苗不存在毒力返強(qiáng)、病毒重組突變等安全風(fēng)險(xiǎn)。

3、在11種prv糖蛋白中，gb、gc和gd能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。因此，表達(dá)的重組gb、gc和gd蛋白可以引發(fā)對(duì)prv攻擊的保護(hù)性免疫。據(jù)報(bào)道，gd在細(xì)胞表面識(shí)別脊髓灰質(zhì)炎病毒受體家族的受體，介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的穩(wěn)定結(jié)合，并參與病毒感染的吸附和入侵過程，因此抗gd抗體可以通過抑制gd與病毒受體之間的結(jié)合來誘導(dǎo)更好的保護(hù)反應(yīng)。注射抗gb、gc和gd單克隆抗體的豬和小鼠可以抵抗prv的毒力攻擊。此外，感染表達(dá)prv?gd蛋白的重組痘苗病毒或腺病毒疫苗的動(dòng)物也獲得了免疫力，可以抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。值得注意的是，人類單純皰疹病毒2型(hsv-2)的gd蛋白在人類中誘導(dǎo)高滴度抗體，這也可能是hsv-2亞單位疫苗的重要組成部分。

4、在本申請(qǐng)中，對(duì)prv蛋白進(jìn)行了篩選，以檢測(cè)與prv陽(yáng)性血清反應(yīng)的免疫原性蛋白，并發(fā)現(xiàn)幾種包膜糖蛋白具有相對(duì)較強(qiáng)的免疫原性。因此，我們首先使用bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)prv?gd，分別在小鼠和豬體進(jìn)行保護(hù)試驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，gd重組蛋白可以為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供100％的保護(hù)作用，同時(shí)減少小鼠和豬的組織病理學(xué)損傷，說明在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的prvgd重組蛋白具有作為prv亞單位候選疫苗的潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的是提供一種偽狂犬病毒gd重組蛋白，所述的gd重組蛋白從n端到c端的方向依次包括信號(hào)肽、連接肽、gd蛋白第21-350位、酶切位點(diǎn)、his標(biāo)簽，所述的gd蛋白第21-350位的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

2、優(yōu)選的，所述的信號(hào)肽為bv?gp64、melittin、chitinase、hiv-env中的一種或幾種。

3、優(yōu)選的，所述的his標(biāo)簽設(shè)置有至少6個(gè)。

4、優(yōu)選的，所述的his標(biāo)簽設(shè)置有6個(gè)。

5、本發(fā)明的第二目的是提供所述gd重組蛋白相關(guān)的生物材料為如下b1)-b5)中任一所示：

6、b1)編碼所述gd重組蛋白的核酸分子；

7、b2)含有b1)所述核酸分子的表達(dá)盒；

8、b3)含有b1)所述核酸分子的重組載體、或含有b2)所述表達(dá)盒的重組載體；

9、b4)含有b1)所述核酸分子的重組微生物、或含有b2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或含有b3)所述重組載體的重組微生物；

10、b5)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系、或含有b2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系。

11、本發(fā)明的第三目的是提供所述的gd重組蛋白在如下p1-p3中任一所示的應(yīng)用：

12、p1.所述的gd重組蛋白在制備抗偽狂犬病毒血清中的應(yīng)用；

13、p2.所述的gd重組蛋白在制備偽狂犬病毒抗體中的應(yīng)用；

14、p3.所述的gd重組蛋白在制備抗偽狂犬病毒疫苗中的應(yīng)用；

15、所述的gd重組蛋白從n端到c端的方向依次包括信號(hào)肽、連接肽、gd蛋白第21-350位、酶切位點(diǎn)、his標(biāo)簽，所述的gd蛋白第21-350位的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

16、本發(fā)明的第四目的是提供一種偽狂犬病亞單位疫苗，所述的偽狂犬病亞單位疫苗包括所述的gd重組蛋白。

17、優(yōu)選的，所述的偽狂犬病亞單位疫苗還包括佐劑。

18、優(yōu)選的，所述的佐劑為化學(xué)類免疫佐劑。

19、本發(fā)明的第五目的是提供所述的偽狂犬病亞單位疫苗在制備預(yù)防或治療偽狂犬病制品中的應(yīng)用。

20、本發(fā)明的第六目的是提供一種所述的偽狂犬病亞單位疫苗的制備方法，所述的方法是將偽狂犬病病毒jm株的包膜蛋白gd乳化即得。

21、本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明提供了一種偽狂犬病毒gd重組蛋白，所述的偽狂犬病毒gd重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，具有制備亞單位疫苗的潛力。(2)通過所述的偽狂犬病毒gd重組蛋白制備得到的亞單位疫苗，能夠產(chǎn)生具有中和活性的特異性抗體，當(dāng)小鼠和豬攻毒后沒有死亡，表明gd的保護(hù)率為100％，病理切片僅顯示輕微的病理變化。

技術(shù)特征：

1.一種偽狂犬病毒gd重組蛋白，其特征在于，所述的gd重組蛋白從n端到c端的方向依次包括信號(hào)肽、連接肽、gd蛋白第21-350位、酶切位點(diǎn)、his標(biāo)簽，所述的gd蛋白第21-350位的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。

2.如權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒gd重組蛋白，其特征在于，所述的信號(hào)肽為bv?gp64、melittin、chitinase、hiv-env中的一種或幾種。

3.如權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒gd重組蛋白，其特征在于，所述的his標(biāo)簽設(shè)置有至少6個(gè)。

4.與權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述gd重組蛋白相關(guān)的生物材料為如下b1)-b5)中任一所示：

5.如權(quán)利要求1所述的gd重組蛋白在如下p1-p3中任一所示的應(yīng)用：

6.一種偽狂犬病亞單位疫苗，其特征在于，所述的偽狂犬病亞單位疫苗包括權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的gd重組蛋白。

7.如權(quán)利要求6所述的偽狂犬病亞單位疫苗，其特征在于，所述的偽狂犬病亞單位疫苗還包括佐劑。

8.如權(quán)利要求7所述的偽狂犬病亞單位疫苗，其特征在于，所述的佐劑為化學(xué)類免疫佐劑。

9.如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的偽狂犬病亞單位疫苗在制備預(yù)防或治療偽狂犬病制品中的應(yīng)用。

10.一種如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的偽狂犬病亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，所述的方法是將偽狂犬病病毒jm株的包膜蛋白gd乳化即得。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種偽狂犬病毒gD重組蛋白、亞單位疫苗及其制備方法和應(yīng)用，所述的gD重組蛋白從N端到C端的方向依次包括信號(hào)肽、連接肽、gD蛋白第21?350位、酶切位點(diǎn)、His標(biāo)簽，所述的gD蛋白第21?350位的氨基酸序列如SEQ?ID?No.4所示，所述的偽狂犬病毒gD重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，制備得到的亞單位疫苗，能夠產(chǎn)生具有中和活性的特異性抗體，小鼠攻毒后沒有死亡，保護(hù)率為100％，豬攻毒后保護(hù)率為100％，病理切片僅顯示輕微的病理變化，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：翁長(zhǎng)江,黃麗,張朝霞
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心哈爾濱分中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28