本發明涉及檢測由真菌病原體引起的草坪草中病害的方法，該方法用環介導等溫擴增(lamp)測定這樣的草坪草樣品以檢測來自一種或多種真菌的核酸。

背景技術：

1、如在例如us?6410278(eiken公司)中所述，lamp或環介導等溫擴增是一種dna擴增方法，其特征在于使用至少4個或更多個不同的引物(參見，例如，http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/primer.html)，這些引物被特異性設計以識別靶基因上的6個不同區域，并且反應過程在恒定的溫度下通過鏈置換反應進行。通過將生物樣品或其核酸提取物、引物、具有鏈置換活性的dna聚合酶、和底物的混合物在恒定的溫度下(大約65℃)孵育，可在單個步驟中完成目的靶核酸的擴增和檢測。它提供了高擴增效率，其中dna在15-60分鐘內被多次擴增。由于其高特異性，擴增產物的存在可以表明靶基因的存在(http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html)。

2、草坪草管理者在將草坪草保持在用戶所期望的質量標準方面面臨著許多問題。雖然問題很多，但與病害有關(包括由真菌病原體引起的病害)的那些問題對管理和控制特別具有挑戰性。例如，病害可以影響高爾夫球場上的草坪草植物，從而引起由質量降低(包括可玩性)造成的收入損失。對于高爾夫球場管理者而言，常見問題的一個實例是知道存在哪種病害，以便可以采取適當的和及時的管理技術。草坪病原性微生物引起的草坪病害包括例如炭疽病、全蝕病、夏季斑枯病、雪腐病、腐霉枯萎病(pythium?blight)、褐斑病、幣斑病(dollar?spot)等。

3、用于控制病原體的農業活性化學品，例如殺真菌劑，通常根據病害壓力的程度、病原體群體、天氣等需要施用于高爾夫球場。然而，殺真菌劑的施用受球場預算、適當設備可用性、以及施用農業活性化學品的合格人員的可用性高度控制。

4、考慮到這些問題，建立快速且可靠的草坪病原性真菌檢測方法將是非常有用的。已知的pcr測定對于高爾夫球場或其他集中管理的草坪草或專業景觀環境沒有實用意義，因為pcr需要專業的實驗室技能和儀器。例如，在wo?2009147017中已知并描述了用于檢測草坪草中真菌病害的某些其他分子生物學方法，其涉及trflp方法。

技術實現思路

1、因此，本發明涉及用于檢測草坪樣品中dna的存在的lamp測定，該dna與引起相關草坪病害的選擇的真菌病原體相關聯，這些草坪病害包括例如炭疽病、全蝕病、夏季斑枯病、雪腐病、腐霉枯萎病、褐斑病和幣斑病。

2、為了便于及時地和有效檢測草坪草病害病原體，并提高草坪草病害治療的成本和的有效性，根據本發明的lamp測定可用于早期檢測與引起相關草坪病害的真菌病原體相關聯的dna。根據本發明，lamp方法適合使用衍生自靶病害病原體的至少四個且優選地六個或更多個核酸序列的引物組。更特別地，本發明方法提供了：用于lamp測定選擇的引物組中使用的每個引物具有15個到50個核酸，并且其中該組中的引物選自靶標真菌內的特定dna基因座。

3、根據本發明，提供了用環介導等溫擴增(lamp)測定檢測草坪草樣品中真菌dna的方法，該測定含有用于草坪病原性真菌的真菌dna(核酸)的引物，這些草坪病原性真菌選自由以下組成的組：幣斑病核盤菌(sclerotinia?homoeocarpa)、立枯絲核菌物種(rhizoctonia?solani?spp.)、瓜果腐霉菌(pythium?aphanidermatum)、禾頂囊殼菌物種(gaeumannomyces?graminis?spp.)、雪霉葉枯菌物種(microdochium?nivale?spp.)、夏季斑枯病菌(magnaporthe?poae)、禾生炭疽菌(colletotrichum?graminicola)、谷物炭疽菌(colletotrichum?cereale)和終極腐霉菌終極變種(pythium?ultimum?var.ultimum)(靶標真菌)。本發明的lamp測定使用至少四個且優選地六個或更多個核酸序列的引物組，其中該組中的每個引物具有15個到50個核酸，并且其中待檢測的真菌dna獲得自靶標真菌病原體。本lamp測定方法中可用的引物選自靶標真菌的特定的內部轉錄間隔區或基因，以提供改進的測定結果。

4、在一個特別的實施例中，雪霉葉枯菌物種靶標真菌選自雪霉葉枯菌雪霉變種(microdochium?nivale?var.nivale)和雪霉葉枯菌大孢變種(microdochium?nivalevar.majus)。在另一個實施例中，禾頂囊殼菌物種靶標真菌選自禾頂囊殼菌燕麥變種(gaeumannomyces?graminis?var.avenae)、禾頂囊殼菌水稻變種(gaeumannomycesgraminis?var.graminis)和禾頂囊殼菌小麥變種(gaeumannomyces?graminisvar.tritici)。在其它實施例中，立枯絲核菌物種靶標真菌選自立枯絲核菌ag2-2iv和立枯絲核菌ag2-2iiib。

5、在本發明的上下文中，用本發明的lamp測定檢測草坪樣品中的真菌dna可以指示真菌病原體的存在，并且還可以協助評估如下的草坪病害病癥的發生或存在：

6、

7、在一個實施例中，

8、(a)用于幣斑病核盤菌dna的引物組選自seq?id?no:1的dna內；

9、(b)用于立枯絲核菌dna的引物組選自seq?id?no:2或seq?id?no:9的dna內；

10、(c)用于雪霉葉枯菌物種dna(優選地雪霉葉枯菌雪霉變種)的引物組選自seq?idno:3的dna內；

11、(d)用于瓜果腐霉菌dna的引物組選自seq?id?no:4或seq?id?no:10的dna內；

12、(e)用于禾頂囊殼菌物種dna(優選地禾頂囊殼菌燕麥變種、禾頂囊殼菌水稻變種或禾頂囊殼菌小麥變種)的引物組選自seq?id?no:5或seq?id?no:8的dna內；

13、(f)用于雪霉葉枯菌物種dna(優選地雪霉葉枯菌大孢變種)的引物組選自seq?idno:6的dna內；

14、(g)用于夏季斑枯病菌dna的引物組選自seq?id?no:7的dna內；

15、(h)用于禾生炭疽菌dna的引物組選自seq?id?no:11的dna內；

16、(i)用于谷物炭疽菌dna的引物組選自seq?id?no:12的dna內；以及

17、(j)用于終極腐霉菌終極變種dna的引物組選自seq?id?no:13的dna內。

18、優選地，根據本發明的適用于在檢測草坪樣品中真菌dna中使用的lamp引物組包含四個引物，這些引物包括：一對正向(fip)和反向(bip)內引物，以及一對正向(f3)和反向(b3)外引物。更優選地，適用于在本發明中使用的lamp引物組包括添加正向環引物(lf)和/或反向環引物(lb)，以加速草坪樣品中存在的核酸的擴增，并減少可能存在于這樣的草坪樣品中的任何靶標真菌的檢測時間。下面列出的lamp引物組實施例涉及根據本發明的方法檢測草坪樣品中的靶標真菌dna。

19、在以下與根據本發明的seq?id?no?14-91的引物相關聯的實施例的描述中，將理解的是可用于本發明的引物各自獨立地且分別地具有與14-91的seq?id的引物至少90％、優選地至少95％、更優選地至少96％和甚至更優選地至少97％同一的序列。

20、在一個特別優選的實施例中，可用于本發明的引物各自獨立地且分別地具有與14-91的seq?id的引物至少98％、更優選地至少99％同一的序列。最優選地，可用于本發明的引物各自獨立地且分別地具有與14-91的seq?id同一的序列。

21、因此，本發明提供了用環介導等溫擴增(lamp)測定檢測草坪草樣品中真菌dna的方法，該測定含有用于至少一種草坪病原性真菌的真菌dna的引物，這些草坪病原性真菌選自：幣斑病核盤菌、立枯絲核菌物種、瓜果腐霉菌、禾頂囊殼菌物種、雪霉葉枯菌物種、夏季斑枯病菌、禾生炭疽菌、谷物炭疽菌和終極腐霉菌終極變種，該方法包括：使草坪樣品經受lamp反應，其中該lamp反應使用四個或更多個核酸序列的引物組，該組中的每個引物具有15個到50個核酸，并且其中引物的組包含至少一個如下所述的引物組。

22、在一個實施例中，用于檢測幣斑病核盤菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:15和27。

23、在另一個實施例中，用于檢測幣斑病核盤菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:14、15、16和17。

24、在其它實施例中，用于檢測幣斑病核盤菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:14、15、16、17、18和19。

25、在其它實施例中，用于檢測立枯絲核菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:23。

26、在另一個實施例中，用于檢測立枯絲核菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:63、64和65。

27、在另一個實施例中，用于檢測立枯絲核菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:20、21、22和23。

28、在另一個實施例中，用于檢測立枯絲核菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:62、63、66和67。

29、在又另一個實施例中，用于檢測立枯絲核菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:62、63、64、65、66和67。

30、在另一個實施例中，用于檢測立枯絲核菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:20、21、22、23、24和25。

31、在另一個實施例中，用于檢測雪霉葉枯菌物種(優選地雪霉葉枯菌雪霉變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:27、28和29。

32、在另一個實施例中，用于檢測雪霉葉枯菌物種(優選地雪霉葉枯菌雪霉變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:26、27、28和29。

33、在其它實施例中，用于檢測雪霉葉枯菌物種(優選地雪霉葉枯菌雪霉變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:26、27、28、29、30和31。

34、在一個實施例中，用于檢測瓜果腐霉菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:33、36和37。

35、在另一個實施例中，用于檢測瓜果腐霉菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:32、33、36和37。

36、在另一個實施例中，用于檢測瓜果腐霉菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:32、33、34、35、36和37。

37、在另一個實施例中，用于檢測瓜果腐霉菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:69、70和71。

38、在另一個實施例中，用于檢測瓜果腐霉菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:68、69、72和73。

39、在另一個實施例中，用于檢測瓜果腐霉菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:68、69、70、71、72和73。

40、在一個實施例中，用于檢測禾頂囊殼菌物種(優選地禾頂囊殼菌燕麥變種、禾頂囊殼菌水稻變種或禾頂囊殼菌小麥變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:60。

41、在另一個實施例中，用于檢測禾頂囊殼菌物種(優選地禾頂囊殼菌燕麥變種、禾頂囊殼菌水稻變種或禾頂囊殼菌小麥變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:42和43。

42、在其它實施例中，用于檢測禾頂囊殼菌物種(優選地禾頂囊殼菌燕麥變種、禾頂囊殼菌水稻變種或禾頂囊殼菌小麥變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:38、39、42和43。

43、在其它實施例中，用于檢測禾頂囊殼菌物種(優選地禾頂囊殼菌燕麥變種、禾頂囊殼菌水稻變種或禾頂囊殼菌小麥變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:56、57、60和61。

44、在另一個實施例中，用于檢測禾頂囊殼菌物種(優選地禾頂囊殼菌燕麥變種、禾頂囊殼菌水稻變種或禾頂囊殼菌小麥變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:38、39、40、41、42和43。

45、在另一個實施例中，用于檢測禾頂囊殼菌物種(優選地禾頂囊殼菌燕麥變種、禾頂囊殼菌水稻變種或禾頂囊殼菌小麥變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:56、57、58、59、60和61。

46、在一個實施例中，用于檢測雪霉葉枯菌物種(優選地雪霉葉枯菌大孢變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:48和49。

47、在其它實施例中，用于檢測雪霉葉枯菌物種(優選地雪霉葉枯菌大孢變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:44、45、48和49。

48、在又另一個實施例中，用于檢測雪霉葉枯菌物種(優選地雪霉葉枯菌大孢變種)dna的引物組包含或選自seq?id?no:44、45、46、47、48和49。

49、在另一個實施例中，用于檢測夏季斑枯病菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:54和55。

50、在其它實施例中，用于檢測夏季斑枯病菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:50、51、54和55。

51、在另一個實施例中，用于檢測夏季斑枯病菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:50、51、52、53、54和55。

52、在一個實施例中，用于檢測禾生炭疽菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:74、76和77。

53、在其它實施例中，用于檢測禾生炭疽菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:7475、78和79。

54、在另一個實施例中，用于檢測禾生炭疽菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:74、75、76、77、78和79。

55、在另一個實施例中，用于檢測谷物炭疽菌dna的引物組包含或選自seq?id?no?80、82和83。

56、在其它實施例中，用于檢測谷物炭疽菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:80、81、84和85。

57、在另一個實施例中，用于檢測谷物炭疽菌dna的引物組包含或選自seq?id?no:80、81、82、83、84和85。

58、在一個實施例中，用于檢測終極腐霉菌終極變種ldin-rc?dna的引物組包含或選自seq?id?no:86、88和89。

59、在其它實施例中，用于檢測終極腐霉菌終極變種ldin-rc?dna的引物組包含或選自seq?id?no:86、87、90和91。

60、在另一個實施例中，用于檢測終極腐霉菌終極變種ldin-rc?dna的引物組包含或選自seq?id?no:86、87、88、89、90和91。

61、本發明的lamp測定可用于檢測(包括早期檢測)來自草坪真菌的dna，其易于獲得并允許對草坪草的管理和/或維持做相應地調整，這些草坪真菌選自由以下組成的組：草坪樣品中的幣斑病核盤菌、立枯絲核菌、瓜果腐霉菌、禾頂囊殼菌物種、雪霉葉枯菌物種、夏季斑枯病菌、禾生炭疽菌、谷物炭疽菌和終極腐霉菌終極變種。

62、根據本發明，“草坪草”被理解為一年生或多年生禾本科。所述禾本科優選地屬于以下屬中的一種或多種：冰草屬、剪股穎屬、地毯草屬、雀麥屬、野牛草屬、狗牙根屬、假儉草屬、羊茅屬、黑麥草屬、雀稗屬、狼尾草屬、梯牧草屬、早熟禾屬、鈍葉草屬或結縷草屬。更優選地，所述禾本科屬于以下屬中的一種或多種：剪股穎屬、野牛草屬、狗牙根屬、假儉草屬、羊茅屬、黑麥草屬、雀稗屬、狼尾草屬、早熟禾屬、鈍葉草屬或結縷草屬。

63、在一個實施例中，根據本發明的“草坪”被理解為一組草坪草，其覆蓋了地面的表面面積并且經受定期維持。

64、本發明可以與所有的草坪草一起實踐，包括冷季型草坪草以及暖季型草坪草。

65、冷季型草坪草的實例為：早熟禾(poa?l.)，例如草地早熟禾(poa?pratensis?l.)、粗莖早熟禾(poa?trivialis?l.)、加拿大早熟禾(poa?compressa?l.)和一年生早熟禾(poaannua?l.)；剪股穎(agrostis?l.)，例如匍匐剪股穎(agrostis?palustris?huds.)、細弱剪股穎(agrostis?tenius?sibth.)、絨毛剪股穎(agrostis?canina?l.)和小糠草(agrostisalba?l.)；羊茅屬(festuca?l.)，例如匍匐紫羊茅(festuca?rubra?l.)、細羊茅(festucarubra?var.commutata?gaud.)、羊茅(festuca?ovina?l.)、硬羊茅(festuca?longifolia)、高羊茅(festuca?arundinacea?schreb.)、草地羊茅(festuca?elatior?l.)；黑麥草(lolium?l.)，例如多年生黑麥草(lolium?perenne?l.)、多花黑麥草(lolium?multiflorumlam.)；冰草(agropyron?gaertn.)，例如扁穗冰草(agropyron?cristatum(l.)gaertn.)、藍莖冰草(western?wheatgrass，agropyron?smithii?rydb.)。其他冷季型草坪草包括無芒雀麥草(bromus?inermis?leyss.)；以及梯牧草(phleum?l.)。

66、暖季型草坪草的實例是百慕大草(cynodon?l.c.rich)、結縷草(zoysia?willd.)、圣奧古斯丁草(stenotaphrum?secundatum(walt.)kuntze)、假儉草(eremochloaophiuroides(munro.)hack.)、地毯草(axonopus?beauv.)、百喜草(paspalum?notatumflugge.)、鋪地狼尾草(pennisetum?clandestinum?hochst.ex?chiov.)、野牛草(buchloedactyloides(nutt.)engelm.)和海濱雀稗(paspalum?vaginatum?swartz)。

67、lamp方法發明還考慮使用lamp測定檢測草坪草樣品中真菌的試劑盒。如本文所述，可以使用含有一個或多于一個的引物組的測試條。在一個實施例中，多個引物組在用于檢測來自草坪草樣品(采集自特定基因座)的多種病害的測試條上是多重化的。

68、例如，提供了具有滾珠軸承和適合量的裂解緩沖液的bijou管，其中有1立方厘米均質化的草坪樣品，并將其劇烈振蕩1分鐘。測試條的樣品孔含所有重懸浮緩沖液，并且將此測試溶液的液滴放置于測試條的樣品孔中，其中這些孔具有進行lamp反應所需的所有成分(例如，引物組和試劑，如獲得自optigene公司的等溫預混合液(isothermal?mastermix，目錄號iso-001)。在一個實施例中，測試條是多重化的。在另一個實施例中，測試條包括8個孔(兩個對照和6個用于目的草坪病害)。在一個實施例中，測試條與診斷儀器(例如獲得自optigene公司的ii或iii)相關聯。