本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，尤其涉及農(nóng)藥的微生物降解，具體是一種異丙威水解酶基因片段cehar-7。

背景技術(shù)：

1、隨著經(jīng)濟全球化的快速發(fā)展，人們對農(nóng)產(chǎn)品的需求也在日益增多，相對應(yīng)的農(nóng)產(chǎn)品的發(fā)展也越來越快，殺蟲劑是保障農(nóng)產(chǎn)品正常生長的農(nóng)藥之一，也被更多的應(yīng)用，但是殺蟲劑的殘留會對人體以及環(huán)境帶來巨大的危害。自19世紀70年代以來，有機農(nóng)藥基于其滅殺效率高毒性大且分解難度大的特點，一方面被不同國家禁用或者限制使用，另一方面被廣泛的開發(fā)應(yīng)用，氨基甲酸酯類農(nóng)藥就是其中之一。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是在有機磷酸酯之后發(fā)展起來的合成農(nóng)藥，是一種新型廣譜的殺蟲、殺螨劑，屬于膽堿酯酶抑制劑，也是一種內(nèi)分泌干擾劑。異丙威是氨基甲酸酯類農(nóng)藥中使用量較多的殺蟲劑，具有較強的觸殺自效果，對稻飛虱和葉蟬科害蟲有特效。人們通過大量噴灑異丙威來保障水稻產(chǎn)量，但是長期大量的使用異丙威，也逐步加深了環(huán)境中的農(nóng)藥殘留，這將嚴重危害動物和人們的身體健康，甚至將帶來癌癥、畸形和內(nèi)分泌紊亂等嚴重疾病。

2、大量研究表明，異丙威在環(huán)境中消解的主要因素是微生物降解，目前國內(nèi)外分離到多株異丙威降解菌株，但是關(guān)于異丙威降解的關(guān)鍵酶的報道較少，只有來自菌株rhodococcus?sp.d-6的異丙威水解酶ipch。據(jù)報道，同屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的初始降解酶都是水解酶，最早關(guān)于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的水解酶是關(guān)于呋喃丹水解酶基因，tomaseek在菌株achromobactersp.wm111中一個大型質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)呋喃丹水解酶基因mcd，隨后hashimoto等人于2002年從菌株rhizobium?sp.ac100中克隆到了西維因的水解酶基因cehaac100，等人于2016年在菌株novosphingobium?sp.kn65.2中發(fā)現(xiàn)一個與cehaac100序列上高度相似的氨基甲酸酯水解酶基因cehakn65.2，同年konstantina等人于pseudomonassp.oxa20中同樣發(fā)現(xiàn)一個與cehaac100序列上高度相似的氨基甲酸酯水解酶基因cehaoxa20，yan?et?al.于2018年在菌株sphingomonas?sp.cds-1中依舊發(fā)現(xiàn)一個與cehaac100序列上高度相似的氨基甲酸酯農(nóng)藥水解酶基因，同cehakn65.2僅有一個氨基酸不同。最近jiang?etal.于sphingobium?sp.cfd-1發(fā)現(xiàn)一個與cehaac100序列上高度相似的氨基甲酸酯水解酶基因cehacfd-1?，F(xiàn)有專利中也僅對ipch的研究，除此之外，關(guān)于異丙威降解機制的報道也相對較少，這嚴重制約了人們對異丙威的環(huán)境行為和生態(tài)安全方面的研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了一種異丙威水解酶基因cehar-7及其應(yīng)用，能夠有效的水解異丙威，可用于修復(fù)土壤、水體，降解環(huán)境中殘留的殺蟲劑異丙威。

2、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、一種異丙威水解酶基因cehar-7，其核苷酸序列為以下任一：

4、(1)序列表seq?id?no.1的dna序列；

5、(2)序列表seq?id?no.2的氨基酸序列；

6、(3)與氨基甲酸酯類農(nóng)藥水解酶ceha同源性90％以上的序列，優(yōu)選為99％以上的同源性。

7、一種異丙威水解酶cehar-7，該水解酶的氨基酸序列為序列表seq?id?no.2的氨基酸序列。

8、一種異丙威水解酶cehar-7的制備方法，是將上述的異丙威水解酶基因cehar-7克隆入重組表達載體，導(dǎo)入宿主細胞，獲得重組表達的異丙威水解酶cehar-7。

9、其中，所述的表達載體為pet-24b(+)質(zhì)粒，購自novegen公司。

10、其中，所述的宿主細胞為大腸桿菌e.coli?bl21(de3)，購自上海英駿生物技術(shù)有限公司。

11、進一步的，所述的重組表達載體，是將異丙威水解酶基因cehar-7插入pet-24b(+)的nde?i和xho?i位點之間獲得。

12、進一步的，所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的pcr擴增，pcr擴增分別采用了正向引物和反向引物，其中正向引物的如序列表seq?id?no.3所示，反向引物如序列表seq?id?no.4所示。

13、進一步的，所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的表達和純化，異丙威水解酶基因在iptg誘導(dǎo)下表達異丙威水解酶，再通過ni2+-nta親和層析純化異丙威水解酶。

14、基于上述的異丙威水解酶基因cehar-7，可應(yīng)用于通過基因?qū)霕?gòu)建，制備出提高對異丙威的耐受性的轉(zhuǎn)基因作物。

15、基于上述的異丙威水解酶cehar-7，其酶或酶制劑可應(yīng)用于降解環(huán)境中的異丙威，修復(fù)土壤和水體中的異丙威污染。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明獲得的異丙威水解酶cehar-7，能水解異丙威生成鄰異丙基苯酚，可用于制備酶制劑用于修復(fù)土壤、水體，降解環(huán)境中殘留的殺蟲劑異丙威。

技術(shù)特征：

1.一種異丙威水解酶基因cehar-7，其特征在于：核苷酸序列為以下任一：

2.一種異丙威水解酶cehar-7，其特征在于：該水解酶的氨基酸序列為序列表seq?idno.2的氨基酸序列。

3.一種異丙威水解酶cehar-7的制備方法，其特征在于：是將上述的異丙威水解酶基因cehar-7克隆入重組表達載體，導(dǎo)入宿主細胞，獲得重組表達的異丙威水解酶cehar-7。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的表達載體為pet-24b(+)質(zhì)粒，購自novegen公司，所述的宿主細胞為大腸桿菌e.coli?bl21(de3)，購自上海英駿生物技術(shù)有限公司。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的重組表達載體，是將異丙威水解酶基因cehar-7插入pet-24b(+)的nde?i和xho?i位點之間獲得。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的pcr擴增，pcr擴增分別采用了正向引物和反向引物，其中正向引物的如序列表seqid?no.3所示，反向引物如序列表seq?id?no.4所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述的制備方法還包括異丙威水解酶基因的表達和純化，異丙威水解酶基因在iptg誘導(dǎo)下表達異丙威水解酶，再通過ni2+-nta親和層析純化異丙威水解酶。

8.一種異丙威污染環(huán)境的修復(fù)方法，其特征在于，所述方法包括使用權(quán)利要求2中的酶或酶制劑降解環(huán)境中殘留的異丙威。

9.一種轉(zhuǎn)基因作物，其特征在于，所述作物通過將權(quán)利要求1中的基因?qū)霕?gòu)建，以提高對異丙威的耐受性。

10.一種異丙威水解酶cehar-7的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：

技術(shù)總結(jié)
異丙威水解酶基因cehAR?7及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，該基因編碼的酶能夠水解異丙威生成鄰異丙基苯酚，可用于制備酶制劑用于修復(fù)土壤、水體中的異丙威污染，以及構(gòu)建抗(耐)異丙威的轉(zhuǎn)基因作物。

技術(shù)研發(fā)人員：李娜,吳靜,楊迎新,王博含,高奧
受保護的技術(shù)使用者：南陽師范學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24