本發(fā)明涉及一種使用野生型細(xì)菌生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯(pha)和以有效方式提取所生產(chǎn)的pha的方法。pha是一系列的不同的可生物降解的聚合物的總稱，所述聚合物由3-羥基鏈烷酸的聚酯組成。由于應(yīng)用范圍廣泛以及其是完全可生物降解的因此具有很少或沒(méi)有長(zhǎng)期廢棄物問(wèn)題的事實(shí)，因此，這些聚合物是引人關(guān)注的。pha通常分類為短鏈長(zhǎng)度pha(sclpha)、中鏈長(zhǎng)度pha(mclpha)或長(zhǎng)鏈長(zhǎng)度pha(lclpha)，這取決于其構(gòu)成單體的碳原子數(shù)。sclpha包含c3-c5的單體，mclpha包含c6-c14的單體，以及l(fā)clpha包含大于14個(gè)碳(>cl4)的單體。單體鏈長(zhǎng)度的該變化導(dǎo)致聚合物具有不同的性質(zhì)，其中，sclpha和lclpha兩者具有不同的性質(zhì)，sclpha具有高結(jié)晶度并且通常是剛性和易碎的，而lclpha具有粘性并且非常難以處理。sclpha和lclpha的性質(zhì)限制了它們的應(yīng)用范圍。但是，由于sclpha可更容易獲得，因此，需要具有經(jīng)改進(jìn)的性質(zhì)的sclpha。pha結(jié)構(gòu)可以兩種方式變化。首先，pha可根據(jù)側(cè)基的結(jié)構(gòu)而變化，這些側(cè)基(懸垂基團(tuán)，pendant?group)典型地連接至具有(r)-立體化學(xué)的碳原子。側(cè)基形成羥基鏈烷酸的側(cè)鏈，對(duì)pha-碳主鏈沒(méi)有貢獻(xiàn)。其次，pha可根據(jù)其重復(fù)單元的數(shù)量和類型而變化。例如，pha可為均聚物、共聚物或三元共聚物。pha結(jié)構(gòu)的這些變化可導(dǎo)致其物理特性的變化。這些物理特性使pha可用于許多可能具有商業(yè)價(jià)值的產(chǎn)品。單體中的立體化學(xué)可僅為r或s，或者，兩種類型的單體都可存在。這進(jìn)一步影響聚合物的性質(zhì)。通常當(dāng)由生物生產(chǎn)時(shí)幾種類型的pha使pha成為具有可通過(guò)分子設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)的性質(zhì)的多功能(versatile)聚合物家族。例如，短鏈長(zhǎng)度scl-pha分為p3hb，一般簡(jiǎn)稱為聚羥基丁酸酯(phb)，p4hb，(戊酸共聚物)phbv，phbh，p3hb4hb，中鏈長(zhǎng)度mcl-pha為phbh(己酸共聚物)，phbo(辛酸共聚物)，phbd(十二烷酸共聚物)。pha的化學(xué)結(jié)構(gòu)可描述為由以下單元的重復(fù)形成的聚合物鏈：其中r為可變長(zhǎng)度的烷基或烯基，并且m和n為整數(shù)，在一些聚合物中，r和m推測(cè)為(assume)以下值：phb：r=ch3，m=1phbv：r=ch3或ch3-ch2-，m=1p4hb：r=h，m=2p3hb4hb：對(duì)于m=2，r=h，或者，對(duì)于m=1，r=ch3對(duì)于mclpha，r的烷基鏈的長(zhǎng)度可不同，例如，對(duì)于聚羥基己酸酯phbh，r為ch3-ch2-ch2-并且m等于2。由于它們的結(jié)構(gòu)，pha單體單元含有手性碳原子。聚合物可因此包含在它們的構(gòu)型上不同的單體。由于酶途徑，由有機(jī)體合成的pha通常僅含有r構(gòu)型的單體。除了植物和其他有機(jī)體，細(xì)菌對(duì)生產(chǎn)pha也非常有用。近年來(lái)，采取了許多努力來(lái)使用經(jīng)基因修飾或未經(jīng)修飾的細(xì)菌，以便還以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)pha。schlegel等nature?1961,?191,?463-465?“formation?and?utilization?ofpoly-β-hydroxybutyric?acid?by?knallgas?bacteria?(hydrogenomonas)”發(fā)現(xiàn)pha(即phb)可在某些條件下產(chǎn)生，尤其是使用包含co2、h2和o2的氣氛。ayaaki?ishizaki和kenji?tanaka，journal?of?fermentation?andbioengineering?1990,?69(3),?170-174?“batch?culture?of?alcaligenes?eutrophusatcc?17697t?using?recycled?gas?closed?circuit?culture?system”、ayaaki?ishizaki和kenji?tanaka，journal?of?fermentation?and?bioengineering?1991,?71(4)?254-257“production?of?poly-b-hydroxybutyric?acid?from?carbon?dioxide?by?alcaligeneseutrophus?atcc17697t”以及toshihiro?takeshita等j.?fac.?agr.?kyushu?univ.?1993,38(1-2),?55-64，studies?on?dissolved?hydrogen?behavior?in?autotrophic?cultureof?alcaligenes?autrophus?atcc?17697t”公開(kāi)了在自養(yǎng)條件下在細(xì)菌中的phb的合成。該條件的一個(gè)缺點(diǎn)是要求氫和氧的比例，其是爆炸性的(氧>6%)。這限制了這些條件的使用。kenji?tanaka和ayaaki?ishizaki，journal?of?fermentation?andbioengineering,?1994,?77(4),?425-427?“production?of?poly-d-3-hydroxybutyricacid?from?carbon?dioxide?by?a?two-stage?culture?method?employing?alcaligeneseutrophus?atcc?17697?t”公開(kāi)了兩階段異養(yǎng)-自養(yǎng)生長(zhǎng)，其中在自養(yǎng)階段中果糖和o2的量為2-3%。但是，使用有機(jī)底物，降低了細(xì)菌的pha存儲(chǔ)效率。使用co2作為碳源使這些過(guò)程對(duì)于塑料的環(huán)境友好生產(chǎn)非常有價(jià)值，所述塑料甚至是可生物降解的。us5,942,597和wo97/07229a1描述了使用溶劑混合物從含油植物提取pha。在其他pha類型中，目前大多數(shù)phb是通過(guò)使用葡萄糖作為原料的工藝以工業(yè)規(guī)模成功生產(chǎn)的。通過(guò)工業(yè)過(guò)程獲得的phb具有高度結(jié)晶性，因?yàn)樗鼈兊幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)由光學(xué)純的單一單體單元組成(高立構(gòu)規(guī)整性)。然而，從共聚單體引入鏈不規(guī)則性或插入例如4b與3b或其他立構(gòu)規(guī)整性對(duì)于實(shí)現(xiàn)改進(jìn)的柔性以及因此對(duì)于大多數(shù)通用塑料應(yīng)用而言更好的性能和可加工性是非常重要的。現(xiàn)有技術(shù)中提出的程序不適合用于工業(yè)規(guī)模加工。此外，從細(xì)菌產(chǎn)生的pha的提取也是困難的。它們還需要長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。

背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于在細(xì)菌中生產(chǎn)和優(yōu)選進(jìn)一步純化pha的方法，更優(yōu)選以工業(yè)規(guī)模。

2、該目的通過(guò)如獨(dú)立權(quán)利要求中要求保護(hù)的本發(fā)明來(lái)實(shí)現(xiàn)。在從屬權(quán)利要求中描述了有利的實(shí)施方案。

3、本發(fā)明的目的還通過(guò)一種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在下文中，將更詳細(xì)地描述方法的各個(gè)步驟。所述步驟不一定必須按照文中給出的順序進(jìn)行。此外，未明確說(shuō)明的其他步驟可為該方法的一部分。

4、本發(fā)明的目的通過(guò)一種生產(chǎn)pha的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法包括以下步驟：

5、a)?在培養(yǎng)基(media)中在異養(yǎng)條件下使細(xì)菌生長(zhǎng)；

6、b)?在co2、h2和o2的氣氛下在自養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)菌，其中o2的量在10%(v/v)以下(below?10%(v/v))并且壓力為至少1barg。

7、可用于本發(fā)明的細(xì)菌包括可產(chǎn)生pha的任何細(xì)菌，優(yōu)選天然產(chǎn)生pha的細(xì)菌。野生型細(xì)菌是優(yōu)選的。這樣的細(xì)菌不是經(jīng)基因改造的。通過(guò)使用野生類型，該工藝必須滿足不太嚴(yán)格的規(guī)定。

8、在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)菌為嗜糖佩洛單胞菌(pelomonas?saccharophila)(以前也稱為嗜糖假單胞菌(pseudomonas?saccharophila))、lata氮單胞菌(azomonas?lata)(以前也稱為產(chǎn)堿弧菌(alcaligenes?latus))和羅爾斯頓氏菌(r.?eutropha))(也稱為鉤蟲(chóng)貪銅菌(cupriavidus?necator))。這些是非致病性的革蘭氏陰性細(xì)菌，其可在土壤和水中找到。它們的兼性化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)代謝(facultative?chemolithoautotrophic?metabolism)允許它們?cè)谟袡C(jī)化合物上生長(zhǎng)，或者在受到營(yíng)養(yǎng)限制和存在氧氣的情況下分別使用h2和co2作為還原劑和碳源生長(zhǎng)。取決于營(yíng)養(yǎng)物的可得性(可用性，availability)，這兩種模式也可共存。如果在沒(méi)有任何共聚單體的情況下用于本發(fā)明的工藝中，這些細(xì)菌產(chǎn)生phb。

9、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌是選自鉤蟲(chóng)貪銅菌的野生細(xì)菌，甚至更優(yōu)選流(stream)鉤蟲(chóng)貪銅菌h16，其是一種非致病性的革蘭氏陰性流。其他優(yōu)選的流(steams，蒸汽)是可在dsmz-german?collection?of?microorganisms?and?cell?cultures?gmbh以dsm編號(hào)dsm-428、dsm-531、dsm-11098、dsm-3102、dsm-529、dsm-545獲得的流。

10、另外，可使用選自惡臭假單孢菌(preudosomas?putida)或綠膿桿菌(aeuruginosa)的野生細(xì)菌。

11、在第一步中，使細(xì)菌在異養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。這些是利用有機(jī)化合物作為碳和能源的條件。在這些條件下的優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌顯示了指數(shù)生長(zhǎng)。

12、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物(尤其是氮、碳或磷)沒(méi)有限制的條件培養(yǎng)細(xì)菌。

13、通常使用環(huán)境氣氛。

14、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該步驟在環(huán)境壓力或僅由反應(yīng)條件產(chǎn)生的壓力下進(jìn)行，例如在密閉容器中加熱。

15、用于步驟a)的培養(yǎng)基是水性培養(yǎng)基。

16、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于第一步的培養(yǎng)基包含至少一種銨鹽作為氮源，優(yōu)選硫酸銨。

17、作為碳源，可使用不同的有機(jī)物質(zhì)。這可為糖如蔗糖、果糖或葡萄糖，多元醇如甘油，有機(jī)酸或其鹽或酯，如乙酸或蘋(píng)果酸鹽(酯)或乙酸乙酯。碳源優(yōu)選可溶于培養(yǎng)基中。

18、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于第一步的培養(yǎng)基包含至少一種磷酸鹽作為磷源，優(yōu)選磷酸鹽的銨鹽、鈉鹽或鉀鹽，尤其可使用它們的一元形式(monobasic?form)，更優(yōu)選h2po4鹽，更優(yōu)選(nh4)h2po4、kh2po4和/或nah2po4。鹽可使用水合物。

19、氫氧化銨、檸檬酸和/或硫酸可用于調(diào)節(jié)ph。

20、培養(yǎng)基可包含其他的鹽和添加劑，如鎂鹽、鐵鹽、維生素或痕量元素如zn、b、co、cu、ni、mo或mn。

21、培養(yǎng)基的ph優(yōu)選為4.5至7.5，更優(yōu)選6.4至7.1。

22、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)開(kāi)始時(shí)的c的量在2和50g/l之間，優(yōu)選地在5和20g/l之間。

23、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)開(kāi)始時(shí)的n的量在0.1和5g/l之間，優(yōu)選地在0.1和2.5g/l之間。

24、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)開(kāi)始時(shí)的p的量在0.05和5g/l之間，優(yōu)選地在0.1和3.5g/l之間。

25、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)開(kāi)始時(shí)，碳源的量為5至50g/l，優(yōu)選10至50g/l。所述值取決于碳源的摩爾質(zhì)量，并且可適應(yīng)于所需的c的含量。

26、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，5至20g/l的c、0.1至2.5g/l的n和0.1至3.5g/l的p的含量是優(yōu)選的。

27、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將細(xì)菌添加在預(yù)先制備的接種物(inoculum)中。

28、對(duì)于接種物，優(yōu)選5至30g/l的c、0.1至1.5g/l的n和0.2至5g/l的p的含量。

29、步驟a)開(kāi)始的值是指添加接種物后的值。

30、用于接種物的c、n和/或p的優(yōu)選的源與對(duì)于步驟a)的培養(yǎng)基所提及的相同。

31、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)開(kāi)始時(shí)存在以下量：

32、碳源(甘油、蔗糖或葡萄糖或果糖)15至70g/l，(nh4)2so4?1至5g/l，kh2po4?0.5至20g/l，檸檬酸x1h2o?0.1-3g/l和nah2po4?0至2g/l。

33、可存在其他的mg或ca鹽。另外，添加痕量元素溶液，包含zn、mn、b、co、cu、ni和mo。

34、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)開(kāi)始時(shí)，將反應(yīng)器以其總體積的5至20%的體積填充。

35、步驟a)優(yōu)選在20和40℃之間的溫度下，更優(yōu)選在29至35℃之間的溫度下運(yùn)行。

36、可需要對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行攪拌。

37、在細(xì)菌的生長(zhǎng)期間，所存在的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物被消耗。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少一些營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)料到培養(yǎng)基中以使這些營(yíng)養(yǎng)物優(yōu)選地保持在如上所提及的范圍內(nèi)。

38、進(jìn)料可加至反應(yīng)器內(nèi)部的培養(yǎng)基的空間。優(yōu)選在培養(yǎng)期間不移除培養(yǎng)基。

39、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)料溶液以從反應(yīng)器的總體積計(jì)算的在0.1至5%/h之間的速率添加，優(yōu)選0.2至1%。可基于進(jìn)料的含量和/或培養(yǎng)條件，尤其是所使用的壓力來(lái)調(diào)整進(jìn)料速率。

40、進(jìn)料溶液優(yōu)選至少包含至少一種碳源。

41、在另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)料溶液包含至少一種碳源、至少一種氮源。

42、在另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)料溶液包含至少一種碳源、至少一種氮源和至少一種磷源。優(yōu)選的源與對(duì)于步驟a)的培養(yǎng)基所提及的相同。

43、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源與起始條件的碳源相同。

44、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)料溶液包含100至500g/l、優(yōu)選150至300g/l的碳含量。

45、優(yōu)選地，進(jìn)料溶液還包含1至10g/l、優(yōu)選1至5g/l的n的含量。

46、優(yōu)選地，進(jìn)料溶液還包含0.5至15g/l、優(yōu)選1至10g/l的p的含量。

47、優(yōu)選地，進(jìn)料包含如前所提及的或各自以它們的優(yōu)選值的c、n和p的含量。

48、進(jìn)料溶液可包含其他的ca和/或mg鹽，以及酸如檸檬酸。進(jìn)料還可包含痕量元素溶液。

49、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)料包含150至300g/l的c，1至5g/l的n，1至10g/l的p。

50、用于進(jìn)料的c、n和/或p的優(yōu)選的源與對(duì)于步驟a)的培養(yǎng)基所提及的相同。

51、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)料包含以下成分：

52、碳源(葡萄糖或蔗糖或甘油)150至300g/l的c；

53、(nh4)2so4和/或(nh4)h2po4，量為1至5g/l的n；

54、kh2po4?0至15g/l；

55、nah2po4?0至15g/l；

56、細(xì)菌的生長(zhǎng)持續(xù)直到達(dá)到至少10(通過(guò)od在600nm處測(cè)量)、優(yōu)選至少15、更優(yōu)選至少20的細(xì)胞密度。相關(guān)生長(zhǎng)點(diǎn)也可與其他測(cè)量(如時(shí)間或組成)有關(guān)。

57、步驟a)通常運(yùn)行至少5小時(shí)至最高達(dá)40小時(shí)，優(yōu)選10小時(shí)至最高達(dá)25小時(shí)。

58、在下一步中，細(xì)菌在自養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。在這樣的條件下，co2被用作細(xì)菌的碳源。

59、在該步驟中，將培養(yǎng)基與包含h2、co2和o2的氣氛接觸。為了使爆炸的風(fēng)險(xiǎn)最小化，o2的含量小于10%(v/v)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，co2的含量在2%和25%(v/v)之間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，h2的含量為50%至92%(v/v)。

60、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，o2的含量小于8%(v/v)，優(yōu)選小于6%(v/v)。

61、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，o2的含量小于8%(v/v)，co2的含量在2%和25%(v/v)之間，并且h2的含量在50%和92%(v/v)之間。

62、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，o2的含量小于6%(v/v)，co2的含量在5%和20%(v/v)之間，并且h2的含量在50%和92%(v/v)之間。

63、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果存在的話，氣氛中的氮的含量小于1%(v/v)。通過(guò)不對(duì)進(jìn)料到反應(yīng)器中的溶液進(jìn)行脫氣，可將一些少量的氮帶入到反應(yīng)容器中。

64、這樣的氣氛的源可為合成氣。

65、如果添加其他單體的前體，co2的量?jī)?yōu)選在co2?1和25%(v/v)之間，優(yōu)選在2%和25%(v/v)之間，更優(yōu)選2至20%(v/v)。

66、所提及的比率是在步驟b)開(kāi)始時(shí)存在的比率。由于在發(fā)酵期間使用了氣體，因此，在發(fā)酵期間可需要將量調(diào)整至之前的范圍。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟b)期間該比率保持在這些范圍內(nèi)。

67、步驟b)中的壓力為至少1barg或表壓。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，壓力為至少2barg，更優(yōu)選至少3barg。

68、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，壓力范圍為2至20barg，優(yōu)選3至20barg，更優(yōu)選3至10barg。在培養(yǎng)條件下測(cè)量壓力。

69、在步驟b)期間，壓力優(yōu)選保持在這些范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，整個(gè)步驟b)期間的壓力為至少1barg。

70、基于1.013bar的標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，如在本技術(shù)中使用的1barg對(duì)應(yīng)于2.013bar的絕對(duì)壓力。所有其他范圍都相應(yīng)地調(diào)整。

71、通過(guò)使用增加的壓力，pha的生長(zhǎng)被加速并且步驟b)的持續(xù)時(shí)間被縮短。出人意料地，與在沒(méi)有增加的壓力的情況下獲得的pha相比，增加的壓力還導(dǎo)致具有不同的性質(zhì)的pha。

72、優(yōu)選地，不同氣體的含量通過(guò)分壓來(lái)測(cè)量。

73、優(yōu)選地，在步驟b)的持續(xù)時(shí)間內(nèi)壓力保持恒定。更優(yōu)選地，在步驟b)的持續(xù)時(shí)間內(nèi)氣氛的組成和壓力保持恒定。

74、在步驟b)中，不向反應(yīng)器中添加其他的營(yíng)養(yǎng)物。

75、步驟b)中的ph優(yōu)選為6.5至7.5，更優(yōu)選6.8至7.0。可使用酸和/或堿，優(yōu)選硫酸和/或氫氧化銨來(lái)調(diào)節(jié)ph。

76、作為培養(yǎng)基，可使用與步驟a)相同的培養(yǎng)基，但沒(méi)有任何氮源或碳源。

77、在步驟b)中，培養(yǎng)優(yōu)選在至少缺乏氮的條件下運(yùn)行。氮源限制了生物質(zhì)的積累。這導(dǎo)致pha積累。

78、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞分散液直接用于步驟b)作為起始培養(yǎng)基。

79、步驟b)中的溫度優(yōu)選在20℃和45℃之間，更優(yōu)選在25℃和35℃之間。

80、在反應(yīng)期間可需要對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行攪拌。

81、在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在步驟b)處添加其他單體的前體以獲得phb的共聚物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些是有機(jī)酸的鹽，優(yōu)選鈉鹽或鉀鹽。這樣的鹽的實(shí)例是丙酸、丁酸、戊酸或己酸的相應(yīng)鹽，這取決于所需的側(cè)鏈的長(zhǎng)度。這些前體通常以在所生產(chǎn)的pha中獲得5%至30%、優(yōu)選5%至20%(以摩爾比計(jì))的單位含量的量添加。這些前體優(yōu)選添加至最高達(dá)1至20g/l、優(yōu)選2至10g/l的量。

82、運(yùn)行步驟b)中的反應(yīng)直到形成一定量的pha，通常直到形成從整個(gè)生物質(zhì)的干重計(jì)算的50重量%至90重量%的pha的含量。

83、在這些條件下，可運(yùn)行步驟b)直到達(dá)到大于50g/l、優(yōu)選大于100g/l的最終細(xì)胞密度。

84、還優(yōu)選在pha和/或phb的mw由于副反應(yīng)而開(kāi)始降低之前停止反應(yīng)。

85、培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間通常為20至80小時(shí)，優(yōu)選30至60小時(shí)，更優(yōu)選30至50小時(shí)。

86、步驟b)可在與步驟a)相同或不同的反應(yīng)器中運(yùn)行，優(yōu)選在不同的反應(yīng)器中運(yùn)行。

87、如果必要，在兩個(gè)步驟之間進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟，如過(guò)濾或離心。

88、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在接下來(lái)的純化步驟之前將細(xì)胞從培養(yǎng)基分離。

89、也可用醇(如甲醇和/或乙醇)洗滌細(xì)胞。

90、pha在細(xì)菌內(nèi)部形成。對(duì)于提取，幾種方法是可能的。

91、在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞首先通過(guò)機(jī)械應(yīng)力例如增加的大氣壓力破壞。然后使用用于pha的溶劑提取pha，優(yōu)選極性有機(jī)溶劑，更優(yōu)選丙酮或氯仿，尤其是丙酮。

92、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，還添加沸點(diǎn)高于用于pha的溶劑的其他溶劑。例如，具有10至14個(gè)碳原子的油或烷烴。與用于pha的溶劑相比，其他溶劑優(yōu)選以1:20至1:4的重量比使用。

93、如果從該混合物除去用于pha的溶劑，則可將pha作為高純度的薄片收取。優(yōu)選地，用于pha的溶劑通過(guò)加熱除去。用于pha的溶劑可重復(fù)用于進(jìn)一步的提取。

94、細(xì)胞裂解(lysis)也可與提取步驟結(jié)合，因?yàn)楸矊?dǎo)致細(xì)胞裂解。在該實(shí)施方案中，將丙酮和任選地其他溶劑添加至分離的細(xì)胞。與分離的細(xì)胞的重量相比，用于pha的溶劑(尤其是丙酮)和其他溶劑的量?jī)?yōu)選以過(guò)量使用。優(yōu)選以分離的細(xì)胞的重量的至少2倍、更優(yōu)選重量的至少5倍的量。

95、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，添加用于pha的溶劑和其他溶劑，然后將混合物混合并且分離非水相。

96、所產(chǎn)生的pha在除去用于pha的溶劑、尤其是丙酮期間作為薄片獲得。

97、通過(guò)本工藝生產(chǎn)的pha聚合物具有窄的分子量分布。

98、出乎意料的，所產(chǎn)生的pha聚合物是不太結(jié)晶的聚合物，相比于在環(huán)境條件下產(chǎn)生的pha而言。這使得例如phb聚合物比典型的phb聚合物更不太易碎。它們還顯示出比這些聚合物更低的模量。

99、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合物的無(wú)定形含量在25%至50%之間，優(yōu)選30%至40%(用固態(tài)nmr測(cè)量)。

100、通常使用共聚單體來(lái)獲得結(jié)晶性較低的聚合物，這些聚合物通常更光滑且更有彈性。例如，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的純phb顯示出與通過(guò)常規(guī)程序生產(chǎn)的phbv相似的一些性質(zhì)和10mol%共聚單體的含量。同樣對(duì)于用本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的phbv，需要較少量的共聚單體來(lái)獲得相同的性質(zhì)。

101、本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的pha聚合物。

102、聚合物取決于其性質(zhì)可用于各種產(chǎn)品。其也可與其他聚合物共混。

103、本發(fā)明的另一個(gè)目的是包含如前所述的pha聚合物的或由如前所述的pha聚合物形成的模塑制品、粒料或母料。

104、模塑制品可由此以任何方式生產(chǎn)，例如通過(guò)擠出、澆鑄、注射模塑、壓制、燒結(jié)、壓延、吹膜、熔紡、壓縮模塑和/或熱成型，用于汽車構(gòu)建、運(yùn)輸和/或通信中的組件、用于工業(yè)設(shè)備的組件、機(jī)器和工廠構(gòu)建、家用電器、容器、用于醫(yī)療技術(shù)的裝置、用于電氣或電子產(chǎn)品的組件。因此，本發(fā)明同樣涉及根據(jù)本發(fā)明的聚合物材料用于前述目的的用途。

105、聚合物可用于生產(chǎn)包覆材料(coating?material)，箔，膜，層壓物，纖維，模塑部件，模塑制品，注射模塑制品，例如瓶子或纖維，擠出物，容器，包裝材料，涂覆材料(coatingmaterial)，顆粒，珠，微珠和藥物分配器。

106、聚合物可形成為任何從先前產(chǎn)品已知的產(chǎn)品。也可添加通常的添加劑和其他聚合物。

107、本發(fā)明以任意順序和/或任意組合包括以下方面/實(shí)施方案/特征：

108、1.?生產(chǎn)pha的方法，其包括以下步驟：

109、a)在培養(yǎng)基中在異養(yǎng)條件下使細(xì)菌生長(zhǎng)；

110、b)在co2、h2和o2的氣氛下在自養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)菌，其中o2的量在10%(v/v)以下并且壓力為至少1barg。

111、2.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中細(xì)菌是野生型細(xì)菌。

112、3.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中細(xì)菌是鉤蟲(chóng)貪銅菌。

113、4.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中，在步驟a)中，碳源選自糖、多元醇或有機(jī)酸或其鹽或酯。

114、5.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中，在步驟a)中，使細(xì)菌在指數(shù)生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)。

115、6.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中，步驟b)中的壓力為至少2barg。

116、7.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中，步驟b)中的壓力的范圍為2至20barg。

117、8.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中，步驟b)中的co2的含量在2%和25%(v/v)之間。

118、9.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的方法，其中，步驟b)中的h2的含量在50%和92%(v/v)之間。

119、10.?通過(guò)任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的工藝生產(chǎn)的pha聚合物。

120、11.?包含任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的pha聚合物的模塑制品、粒料或母料。

121、12.?任意前述或后續(xù)實(shí)施方案/特征/方面的pha聚合物的用途，其用于生產(chǎn)包覆材料、箔、膜、層壓物、纖維、模塑部件、模塑制品、注射模塑制品、擠出物、容器、包裝材料、包覆材料、顆粒、珠、微珠和藥物分配器。