本公開涉及以高親和力結合b7同源物3(b7h3)的單鏈單克隆抗體。本公開進一步涉及所述單克隆抗體和抗體綴合物的用途，例如用于治療實體瘤。政府支持聲明本發明是根據美國國立衛生研究院授予的項目編號z01?bc010891在政府支持下完成的。美國政府對本發明享有一定的權利。

背景技術：

1、納米抗體是已知最小的抗體抗原結合片段，由大約120個氨基酸組成，分子量為12kd至15kd，大小約為4×2.5nm(霍達巴赫什(khodabakhsh)等人,《國際免疫學評論》(intrev?immunol),37,316-322,2018)。大多數經過充分研究的納米抗體源自于重鏈可變區(vh)，它可以天然存在于駱駝科動物(稱為vhh)和軟骨魚類(vnar)中(馮(feng(馮))等人,《抗體治療》(antib?ther),2,1-11,2019)，并且在體內存在于一些人類重鏈疾病中(普雷利(prelli)和弗朗吉奧內(frangione),《免疫學雜志》(j?immunol),148,949-952,1992)。由于體積小、溶解度高、熱穩定性好、可逆的重折疊能力以及與常規的完整igg相比在體內相對更容易穿透組織，納米抗體可用于醫療應用或作為研究工具(霍達巴赫什等人，《國際免疫學評論》,37,316-322,2018；韋索洛夫斯基(wesolowski)等人,《醫學微生物學和免疫學》(med?microbiol?immunol),198,157-174,2009；霍(ho),《抗體治療》,1,1-5,2018)，第一種納米抗體藥物卡普賽珠單抗(caplacizumab)的批準證明了這一點，它是一種人源化駱駝科vhh，用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜(attp)和血栓形成(埃爾維爾迪(elverdi)和埃斯卡贊(eskazan),《藥物設計開發和治療》(drug?des?devel?ther),13,1251-1258,2019；史高麗(scully)等人，《新英格蘭醫學雜志》(n?engl?j?med),380,335-346,2019)。

2、從歷史上看，駱駝科vhh域抗體一直是研究的主導方向，直到人類vh域抗體的興起(馮等人，《美國科學院院報》(proc?natl?acad?sci?usa),110,e1083-1091,2013；唐(tang)等人，《分子癌治療》(mol?cancer?ther),12,416-426,2013；李(li)等人,《美國科學院院報》,114,e6623-e6631,2017)。在駱駝科的血清中，既有常規igg，也有大量僅重鏈的igg(hcab)，占所有血清免疫球蛋白的45％至75％，具體取決于特定物種(霍達巴赫什等人，《國際免疫學評論》,37,316-322,2018)。hcab由vhh片段、唯一的抗原結合域、之后的ch2和ch3域以及與常規igg中vh-ch1域配對的輕鏈組成。重組vhh域是正在開發的功能實體。

3、有幾個結構特征使自然進化的駱駝科vhh域高度可溶且穩定。第一，人類vh種系中的val37(kabat編號)通常是vhh域中的phe37(或tyr37)(里赫曼(riechmann)和穆爾德曼斯(muyldermans),《免疫學方法雜志》(j?immunol?methods),231,25-38,1999)，其使得所述域的疏水填充更緊湊且穩定，這可能是使vhh特別穩定的驅動因素(筱崎(shinozaki)等人，《生物科學與生物工程雜志》(jbiosci?bioeng),125,654-661,2018)。第二，人類vh種系中的輕鏈接觸殘基g44、l45和w47是vhh中的e44(或q44)、r45(或c45)和g47(或ser、leu、phe)(霍爾特(holt)等人，《生物技術趨勢》(trends?biotechnol),21,484-490,2003)，這使得可接近表面積更親水且更少聚集。此外，在一些vhh域中，w103可以替換為r103。第三，vhh域的cdr3通常比人類/嚙齒動物cdr3更長，并且它們通常在cdr3中包含cys，與cdr1(駱駝)末端或cdr2(美洲駝)開頭的cys形成另外的二硫鍵(韋索洛夫斯基等人,《醫學微生物學和免疫學》,198,157-174,2009)。這種另外的cdr3二硫鍵和典型的c22-c92二硫鍵進一步使vhh域更加穩定(tm值范圍為60-78℃)，并實現可逆地展開/重折疊(霍爾特等人，《生物技術趨勢》,21,484?-490,2003)。

4、第一種非vhh哺乳動物域抗體于1989年從用溶菌酶和鑰孔-血藍蛋白免疫的小鼠脾臟制成的cdna表達文庫中篩選出來，其中兩個小鼠vh域在20nm范圍內顯示對溶菌酶的親和力(沃德(ward)等人,《自然》(nature)341,544-546,1989)，并且首次提出了“單域抗體”(dabs)的名稱。此后，發現了駱駝科vhh，推動了探索人類vh域抗體的想法，人類vh域抗體在制藥和其他應用中更具吸引力。盡管駱駝科域抗體和人類域抗體都已被大量研究，但在獲取資源方面存在一些技術限制，特別是通過免疫發現域抗體。為了克服資源可及性的限制，已經制定了幾種策略以產生人類或人源化vh域抗體。盡管親和力并不總是與免疫抗體一樣高，但原始人類vh域文庫的噬菌體展示是一種經過驗證的方法(馮等人，《美國科學院院報》,110,e1083-1091,2013；唐等人，《分子癌治療》,12,416-426,2013；李(li)等人,《美國科學院院報》,114,e6623-e6631,2017)。產生人類域抗體的另一種方法是使用具有人類vh種系基因的轉基因動物(舒瑟(schusser)等人,《免疫學雜志》,46,2137-2148,2016；詹森斯(janssens)等人,《美國科學院院報》,103,15130-15135,2006)。并非直接分離人類域抗體，產生免疫動物vh域抗體然后人源化也是產生高親和力的類人抗體的方法。

技術實現思路

1、本公開描述了特異性結合b7h3(也稱為cd276)的十種駱駝單域vhh單克隆抗體和兩種兔vh單域抗體。b7h3特異性駱駝抗體(本文稱為rwb12(“b12”)、rwg8(“g8”)、rwc4(“c4”)、rwb2、rwh5、rwd5、rwc3、rwg4、rwd9和rwh1)，以及b7h3-特異性兔抗體(本文稱為rfa1和rfb1)以高親和力結合b7h3。還公開了產生由所公開的納米抗體組成的嵌合抗原受體(car)t細胞。

2、本文提供了結合(例如特異性結合)b7h3的單克隆抗體。在一些實施方案中，所述單克隆抗體包括納米抗體rwb12、rwg8、rwc4、rwb2、rwh5、rwd5、rwc3、rwg4、rwd9、rwh1、rfa1或rfb1的互補決定區(cdr)序列。本文還提供了包括公開的單克隆抗體的綴合物。在一些實例中，提供了包括本文公開的單克隆抗體的car(以及表達car的t細胞和自然殺傷細胞)、免疫綴合物(例如免疫毒素)、多特異性抗體(例如雙特異性t細胞接合劑)、抗體-藥物綴合物(adc)、抗體-納米顆粒綴合物、抗體-放射性同位素綴合物(例如用于癌癥診斷和免疫pet成像)和融合蛋白。

3、本公開還提供了包含b7h3特異性單克隆抗體和藥學上可接受的載體的組合物。

4、本文還提供了編碼本文公開所述的b7h3特異性單克隆抗體、car、免疫綴合物(例如免疫毒素)、多特異性抗體和融合蛋白的核酸分子和載體。進一步提供了包括編碼b7h3單克隆抗體或car的核酸或載體的分離細胞。

5、本文還提供了治療受試者b7h3陽性癌癥的方法，以及抑制受試者b7h3陽性癌癥的腫瘤生長或轉移的方法。在一些實施方案中，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文公開的單克隆抗體，或向所述受試者施用治療有效量的包含本文公開的單克隆抗體的car(或car?t細胞或car?nk細胞)、免疫綴合物(例如免疫毒素)、adc、多特異性抗體、抗體-納米顆粒綴合物或融合蛋白。

6、本文進一步提供了檢測樣品中b7h3表達的方法。在一些實施方案中，所述方法包括使所述樣品與本文公開的單克隆抗體接觸，并檢測所述抗體與所述樣品的結合。

7、本文還提供了診斷受試者患有b7h3陽性癌癥的方法。在一些實施方案中，所述方法包括將獲自所述受試者的樣品與本文公開的單克隆抗體接觸，并檢測所述抗體與所述樣品的結合。

8、參照附圖，通過以下詳細的描述，本公開的前述和其他目的與特征將更加清楚。