本發明屬于小核酸藥物領域，本發明目的在于提供一種新型的反義寡核苷酸、其綴合物及其用途。本發明所述反義寡核苷酸及其綴合物可制備用于治療和/或預防乙型肝炎疾病的藥物。

背景技術：

1、乙型病毒性肝炎(又稱乙型肝炎或乙肝或hbv)是嚴重威脅全球的一類傳染病。hbv的外包膜蛋白統稱為乙型肝炎表面抗原(hbsag)。hbsag由三個相關的多肽組成，它們被稱為s、m和l，由重疊的開放閱讀框(orf)編碼。最小的包膜蛋白是具有226個氨基酸的s，稱為s-orf。m和l由上游翻譯起始位點產生，分別向s添加55和108個氨基酸。hbv?s、m和l糖蛋白存在于被稱為dane顆粒的完整的、傳染性hbv病毒粒子的病毒包膜中，并且三者均大量產生和分泌，形成在慢性hbv患者的血液中發現的非傳染性亞病毒球形和絲狀顆粒(均稱為誘餌顆粒)。誘餌顆粒表面上的豐富hbsag被認為會抑制慢性hbv感染(chb)患者的體液免疫和自發清除。

2、目前慢性hbv感染的護理標準是用口服核苷(核苷酸)類似物(如恩替卡韋或替諾福韋)治療，其通過抑制hbv?dna合成來提供對hbv復制的抑制，但不直接作用于病毒抗原，如hbsag即使長期用核苷(核苷酸)類似物治療，也僅顯示出低水平的hbsag清除。在這方面，患有慢性乙型肝炎的患者表現出非常弱的hbv?t細胞反應且缺乏抗-hb抗體，這被認為是這些患者無法清除病毒的原因之一。因此，若能從基因水平沉默病毒的基因表達，阻斷hbv的生成和復制，由此從根本上降低病毒復制和對肝細胞的侵染，無疑將是最為理想的乙肝治療手段。

3、反義技術是作為減少特定基因產物表達的有效手段，其被證明可應用于多種疾病的治療、診斷及研究中，且其也可獨特地適用于調節hbv表達。反義療法與核苷療法的不同之處在于其可直接靶向hbv抗原的轉錄物且因此降低血清hbeag及hbsag水平。由于在hbv感染時產生多種重疊轉錄物，所以單個反義寡聚物除hbeag和hbsag之外還有可能減少hbvdna。因此，反義技術作為減少某些基因產物表達的有效手段可獨特地適用于調節hbv。

技術實現思路

0、
技術實現要素：
和詳細說明

1、本發明目的在于提供一種新型的反義寡核苷酸(aso)、其綴合物及其用途。本發明反義寡核苷酸及其綴合物可制備用于治療和/或預防乙型肝炎疾病的藥物。本發明反義寡核苷酸及其綴合物對hbv具有較高的基因表達抑制活性和/或較低的毒性。

2、一方面，本發明涉及一種修飾的反義寡核苷酸，其具有式(i)所示的結構：

3、5'-x-y-z-3'

4、(i)

5、其中，x為由1-14個連接的核苷酸組成；y為由5至15個連接的脫氧核苷酸組成；z為由1-14個連接的核苷酸組成；且所述反義寡核苷酸包含如seq?id?no:1～seq?id?no:25所示的核苷酸序列之一，且所述反義寡核苷酸為12至20個核苷酸長度，所述的seq?id?no:1～seq?id?no:25的序列信息詳見表1。

6、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述寡核酸用于抑制乙型肝炎病毒表達。

7、在本發明所述的一些實施例中，本發明所述x為由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個連接的核苷酸組成。

8、在本發明所述的一些實施例中，本發明所述z為由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個連接的核苷酸組成。

9、在本發明所述的一些實施例中，本發明所述y為由5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連接的脫氧核苷酸組成。

10、在本發明所述的一些實施例中，本發明所述反義寡核苷酸為由12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個連接的核苷酸組成。

11、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述x和z的中的所有核苷均包含2’-o-甲氧基乙基糖(2’-moe核糖)。

12、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述反義寡核苷酸中所有核苷間的鍵均為硫代磷酸酯鍵。

13、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述反義寡核苷酸中所有胞嘧啶各自獨立地任選地為5位-甲基修飾的胞嘧啶。

14、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述反義寡核苷酸中所有胞嘧啶均為5位-甲基修飾的胞嘧啶。

15、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述反義寡核苷酸包含如seq?id?no:26～seq?id?no:372所示的核苷酸序列之一，所述的seq?id?no:26～seq?id?no:372序列信息詳見表2。

16、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述反義寡核苷酸任選地包括遞送載體部分。

17、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述遞送載體部分為包含脫唾液酸糖蛋白受體(asgp-r)靶向部分或膽固醇綴合物部分。

18、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述asgp-r靶向部分包含galnac或其衍生物。

19、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述asgp-r靶向部分包含通過二價或三價分支接頭連接的galnac或其衍生物。

20、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述asgp-r靶向部分為l-96或daw40007-4，其中，所述l-96和daw40007-4結構分別為：

21、

22、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述反義寡核苷酸的3’末端或5’末端通過磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團或磷酸基團與asgp-r靶向部分連接。

23、另一方面，本發明涉及一種組合物，其包含本發明所述的反義寡核苷酸或其鹽，以及藥學上可接受的輔料和稀釋劑中的至少之一。

24、再一方面，本發明涉及本發明所述的反義寡核苷酸或其組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療主體中hbv相關疾病、病癥或病狀。

25、在本發明所述反義寡核苷酸的一些實施中，所述疾病、病癥或病狀是黃疸、肝纖維化、肝炎、肝硬化、血清肝炎、肝衰竭、肝癌、彌漫性肝細胞炎癥性疾病、噬血細胞綜合征、hbv病毒血癥或與肝臟疾病相關的移植。

26、再一方面，本發明涉及本發明所述的反義寡核苷酸或其組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于降低hbv感染的主體中的hbsag水平。

27、表1：基礎序列反義寡核酸

28、 序列(5’-3’) seq?id?no ggugaagcgaagugc 1 gcagaggtgaagcgaagtgc 2 cagaggtgaagcgaagtgc 3 gcagaggtgaagcgaagtg 4 gcagaggtgaagcgaa 5 cagaggtgaagcgaa 6 agaggtgaagcgaa 7 gaggtgaagcgaagt 8 aggtgaagcgaagt 9 cagaggtgaagcgaagt 10 agaggtgaagcgaagt 11 gaggtgaagcgaagtgc 12 agaggtgaagcgaagtgc 13 gaggtgaagcgaag 14 ggtgaagcgaagtg 15 gtgaagcgaagtgc 16 aggtgaagcgaagtg 17 agaggtgaagcgaag 18 aggtgaagcgaagtgc 19 gaggtgaagcgaagtg 20 cagaggtgaagcgaag 21 agaggtgaagcgaagtg 22 gcagaggtgaagcgaag 23 cagaggtgaagcgaagtg 24 gcagaggtgaagcgaagt 25

29、表1中大寫字母a、u、t、g、c分別表示天然堿基核苷酸。

30、定義和一般術語

31、在本發明中，術語“包含”或“包括”為開放式表達，即包括本發明所指明的內容，但并不排除其他方面的內容。

32、在本發明中，術語“抑制乙型肝炎病毒基因的表達”包括任何水平的乙型肝炎病毒(簡稱乙肝病毒)基因的抑制，例如，乙肝病毒基因表達的至少部分抑制，如抑制至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％。其中，可以基于與乙肝病毒基因表達相關的任何變量的水平來評價乙肝病毒基因的表達，例如，乙肝病毒的mrna水平或乙肝病毒蛋白水平。可以通過與對照水平相比，這些變量中一個或多個的絕對或相對水平的降低來評價抑制。對照水平可以是本領域中利用的任何類型的對照水平，例如，給藥前的基線水平，或從未處理或用對照(如，僅用緩沖劑的對照或無活性劑對照)處理的相似受試者、細胞或樣品測定的水平。

33、在本發明中，“藥物組合物”可指用于疾病的治療，也可用于細胞的體外培養實驗。用于疾病的治療時，術語“藥物組合物”通常是指單位劑量形式，并且可以通過制藥領域中熟知的方法的任何一種進行制備。所有的方法包括使活性成分與構成一種或多種附屬成分的輔料相結合的步驟。通常，通過均勻并充分地使活性aso與液體輔料、細碎固體輔料或這兩者相結合，制備組合物。

34、“核苷間的鍵”意指能夠將兩個實體(如核苷酸)共價連接在一起的基團。具體的例子包括磷酸酯基團和硫代磷酸酯基團。

35、術語“載體部分”指意在攜帶或傳輸本發明寡聚物到其所需位置如所需的解剖學位置的分子載體。

36、在一些實施方案中，載體部分包含親和力等于或大于半乳糖的脫唾液酸糖蛋白受體(asgp-r)靶向部分。aspg-r靶向部分可以選自半乳糖、半乳糖胺、n-甲酰半乳糖胺、n-乙酰半乳糖胺(galnac)、n-丙酰半乳糖胺、n-正丁酰半乳糖胺、和n-異丁酰半乳糖胺。在一些實施方案中，靶向綴合物部分的脫唾液酸糖蛋白受體是單價的。在其他實施方案中，載體組分包含半乳糖簇，如靶向綴合物部分的二價、三價或四價脫唾液酸糖蛋白受體(即含有1、2、3或4個能夠與脫唾液酸糖蛋白受體結合的末端糖部分)。在一些實施方案中，載體組分包含galnac(n-乙酰半乳糖胺)，如單價、二價、三價或四價galnac。galnac綴合物可以用來將化合物靶向肝臟。優選的載體組分是n-乙酰半乳糖胺三聚體。在一些實施方案中，載體部分是或包含糖部分。糖綴合物部分包括但不限于半乳糖、乳糖、n-乙酰半乳糖胺、甘露糖和甘露糖-6-磷酸。糖綴合物可以用來增強在一系列組織如肝臟和/或肌肉中的遞送或活性。

37、在本發明中，術語“藥學上可接受的”是指物質或組合物必須與包含制劑的其它成分和/或用其治療的哺乳動物化學上和/或毒理學上相容。

38、在本發明中，術語“藥學上可接受的輔料”均可包括任何溶劑、固體賦形劑、稀釋劑或其他液體賦形劑等等，適合于特有的目標劑型。除了任何常規的輔料與本發明的aso不相容的范圍，例如所產生的任何不良的生物效應或與藥學上可接受的組合物的任何其他組分以有害的方式產生的相互作用，它們的用途也是本發明所考慮的范圍。

39、如本發明所使用，“化學修飾”或“修飾”意指當與天然存在的對應物相比時具有化學差異的結構，包括經化學手段的所有改變，例如化學部分的添加或去除，或以一個化學部分取代另一個化學部分。

40、本發明化合物可以是不對稱的，例如，具有一個或多個立體異構體。除非另有說明，所有立體異構體都包括，如對映異構體和非對映異構體。本發明含有不對稱碳原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或通過使用手性原料或手性試劑合成。

41、可以通過手性合成或手性試劑或者其他常規技術制備光學活性的(r)-和(s)-異構體以及d和l異構體。如果想得到本發明某化合物的一種對映體，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來制備，其中將所得非對映體混合物分離，并且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有堿性官能團(如氨基)或酸性官能團(如羧基)時，與適當的光學活性的酸或堿形成非對映異構體的鹽，然后通過本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然后回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是通過使用色譜法完成的，所述色譜法采用手性固定相，并任選地與化學衍生法相結合(例如由胺生成氨基甲酸鹽)。

42、本發明還包括一些與本發明中記載的那些相同的，但一個或多個原子被原子量或質量數不同于自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本發明化合物。可結合到本發明化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，諸如分別為2h、3h、11c、13c、14c、13n、15n、15o、17o、18o、31p、32p、35s、18f、123i、125i和36cl等。

43、除另有說明，當一個位置被特別地指定為氘(d)時，該位置應理解為具有大于氘的天然豐度(其為0.015％)至少1000倍的豐度的氘(即，至少10％的氘摻入)。示例中化合物的具有大于氘的天然豐度可以是至少1000倍的豐度的氘、至少2000倍的豐度的氘、至少3000倍的豐度的氘、至少4000倍的豐度的氘、至少5000倍的豐度的氘、至少6000倍的豐度的氘或更高豐度的氘。本發明還包括各種氘化形式的式(i)化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。本領域技術人員能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(i)化合物。在制備氘化形式的式(i)化合物時可使用市售的氘代起始物質，或可使用常規技術采用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

44、本發明所述的綴合基團可以增強治療劑向諸如人或動物的對象內特定靶位置(例如，特定器官或組織)的遞送。在本發明的一些實施方式中，所述綴合基團可以增強表達抑制性寡聚核苷酸的靶向遞送。在本發明的一些實施方式中，綴合基團可以增強表達抑制性寡聚核苷酸向肝臟的遞送。

45、本發明所述的綴合基團可以直接或間接地連接至化合物，諸如治療劑，例如，表達抑制性寡聚核苷酸，例如，表達抑制性寡聚核苷酸的3’或5’末端。在本發明的一些實施方式中，表達抑制性寡聚核苷酸包括一個或多個修飾的核苷酸。在本發明的一些實施方式中，表達抑制性寡聚核苷酸是aso。在一些實施方式中，本發明所公開的綴合基團經由磷酸酯、硫代磷酸酯或膦酸酯基團在3’末端與表達抑制性寡聚核苷酸試劑連接。

46、本發明中立體化學的定義和慣例的使用通常參考以下文獻：s.p.parker,ed.,mcgraw-hill?dictionary?of?chemical?terms(1984)mcgraw-hill?book?company,newyork；and?eliel,e.and?wilen,s.,"stereochemistry?of?organic?compounds",johnwiley&sons,inc.,new?york,1994.本發明的化合物可以包含不對稱中心或手性中心，因此存在不同的立體異構體。本發明的化合物所有的立體異構形式，包括但絕不限于，非對映異構體，對映異構體，阻轉異構體，和它們的混合物，如外消旋混合物，組成了本發明的一部分。很多有機化合物都以光學活性形式存在，即它們有能力旋轉平面偏振光的平面。在描述光學活性化合物時，前綴d、l或r、s用來表示分子手性中心的絕對構型。前綴d、l或(+)、(-)用來命名化合物平面偏振光旋轉的符號，(-)或l是指化合物是左旋的，前綴(+)或d是指化合物是右旋的。這些立體異構體的化學結構是相同的，但是它們的立體結構不一樣。特定的立體異構體可以是對映體，異構體的混合物通常稱為對映異構體混合物。50：50的對映體混合物被稱為外消旋混合物或外消旋體，這可能導致化學反應過程中沒有立體選擇性或立體定向性。術語“外消旋混合物”和“外消旋體”是指等摩爾的兩個對映異構體的混合物，缺乏光學活性。

47、術語“互變異構體”或“互變異構的形式”是指不同能量的結構的同分異構體可以通過低能壘互相轉化。例如質子互變異構體(即質子轉移的互變異構體)包括通過質子遷移的互變，如酮-烯醇和亞胺-烯胺的同分異構化作用。

48、術語“組合物”表示含有一種或多種本發明所述aso或其生理學上可藥用的鹽或前體的藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學可藥用的載體和賦形劑。組合物的目的是促進對生物體的給藥，利于活性成分的吸收進而發揮生物活性。

49、術語“可藥用賦形劑”或“藥學上可接受的賦形劑”包括但不限于任何已經被美國食品和藥物管理局批準對于人類或家畜動物使用可接受的任何助劑、載體、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增香劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。

50、如無特殊說明，本發明的“化合物”、“配體”、“核酸綴合物”、“核酸”均可獨立地以鹽、混合鹽或非鹽(例如游離酸或游離堿)的形式存在。當以鹽或混合鹽的形式存在時，其可為藥學上可接受的鹽。

51、術語“可接受的鹽”包括可接受的酸加成鹽和藥學上可接受的堿加成鹽。“可接受的酸加成鹽”是指能夠保留游離堿的生物有效性而無其它副作用的，與無機酸或有機酸所形成的鹽。無機酸鹽包括但不限于鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機酸鹽包括但不限于甲酸鹽、乙酸鹽、2,2-二氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、十一碳烯酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、癸二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、油酸鹽、肉桂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、谷氨酸鹽、焦谷氨酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、4-氨基水楊酸鹽、萘二磺酸鹽等。這些鹽可通過本領域已知的方法制備。

52、“藥學上可接受的堿加成鹽”是指能夠保持游離酸的生物有效性而無其它副作用的、與無機堿或有機堿所形成的鹽。衍生自無機堿的鹽包括但不限于鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。優選的無機鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽，優選鈉鹽。衍生自有機堿的鹽包括但不限于以下的鹽：伯胺類、仲胺類及叔胺類，被取代的胺類，包括天然的被取代胺類、環狀胺類及堿性離子交換樹脂，例如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二環己胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺樹脂等。優選的有機堿包括異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己基胺、膽堿及咖啡因。這些鹽可通過本領域已知的方法制備。

53、另外，需要說明的是，除非以其他方式明確指出，在本發明中通篇采用的描述方式“各…和…獨立地為”、“…和…各自獨立地為”和“…和…分別獨立地為”可以互換，應做廣義理解，其既可以是指在不同基團中，相同符號之間所表達的具體選項之間互相不影響，也可以表示在相同的基團中，相同符號之間所表達的具體選項之間互相不影響。

54、在本發明中，術語“任選地”、“任選的”或“任選”通常是指隨后所述的事件或狀況可以但未必發生，并且該描述包括其中發生該事件或狀況的情況，以及其中未發生該事件或狀況的情況。

55、如，本發明所述的“所述反義寡核苷酸中所有胞嘧啶各自獨立地任選地為5位-甲基修飾的胞嘧啶”是指，本發明所述反義寡核苷酸中所有胞嘧啶可以不被修飾，也可以是1個、2個、3個、4個、5個或6個胞嘧啶的5位被甲基修飾。

56、術語“固相支持體”或“固相支持物”具體表示在其上可發生寡核苷酸合成的任何顆粒、珠或表面。例如無機固相支持體和有機固相支持體，均可選擇用于在本發明實施例中。無機固相支持體優選地選自硅膠和可控微孔玻璃珠(controlled-pore?glass，簡稱cpg)。有機固相支持體為樹脂，優選大孔樹脂，更優選高度交聯的聚苯乙烯、tentagel(由低交聯的聚苯乙烯基質組成的接枝共聚物，聚乙二醇(peg或poe)接枝于其上)、聚乙烯乙酸酯(pva)、波羅斯(poros)-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物、氨基聚乙二醇和纖維素等。本發明的優選實施例利用基于cpg的固相支持體。許多其他可購買的固相支持體均屬于本發明。

57、本發明的反義寡核苷酸、反義寡核苷酸綴合物的組合物、給藥和治療疾病方法

58、本發明的寡核苷酸和本發明的寡核苷酸綴合物可以用于藥物制劑和組合物中。適當地，這類組合物包含可藥用稀釋劑、載體、鹽或輔劑。

59、本發明的藥物組合物可以包括可藥用載體，所述可藥用載體可以含有提供多種功能的多種組分，所述功能包括調節藥物濃度、調節溶解度、化學穩定作用、調節粘度、吸收增強、調節ph等。

60、藥用載體可以包括合適的液體溶媒或賦形劑和任選的輔助添加物或添加物。液體溶媒和賦形劑是常規和市售的。示意性藥用載體是蒸餾水、生理鹽水、右旋糖水溶液等。對于水溶性制劑，藥物組合物優選地包含緩沖液如磷酸鹽緩沖液或其他有機酸鹽，優選地處于ph?6.5至8范圍內。對于含有微溶性反義化合物的制劑，可以使用微乳液，例如通過按0.04-0.05％(w/v)的量使用非離子表面活性劑如聚山梨醇酯-80，以增加溶解度。其他組分可以包括抗氧化劑(如抗壞血酸)、親水聚合物，如，單糖、二糖和其他糖類(包括纖維素或其衍生物、糊精)、螯合劑，如edta及藥物科學技術人員熟知的類似組分，例如，remington'spharmaceutical?science,最新版(mack?publishing?company,easton,pa.)。

61、本發明的寡核苷酸包括其可藥用鹽，包括堿土金屬(例如，鈉或鎂)、銨或nx4+(其中x是c1-c4烷基)的那些鹽。其他可藥用鹽包括有機羧酸鹽如甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、羥乙基磺酸鹽、乳糖酸鹽和琥珀酸；有機磺酸鹽如甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、甲苯磺酸鹽和苯磺酸鹽；和無機酸鹽如氫氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽和氨基磺酸鹽。具有羥基的化合物的可藥用鹽包括這類化合物的陰離子，連同合適的陽離子如na+、nh4+等。

62、可通過本領域己知的任何合適途徑向受試者給藥，所述途徑包括但不僅限于：口服或胃腸外途徑，包括靜脈內給藥、肌肉內給藥、皮下給藥、經皮給藥、氣道給藥(氣霧劑)、肺部給藥、鼻部給藥、直腸給藥和局部給藥(包括口腔含化給藥和舌下給藥)，優選靜脈注射內給藥。

63、本發明公開的藥物組合物包括適于胃腸外施用的制劑。制劑可以方便地以單位劑型形式存在并且可以通過藥學領域公知的任何方法來制備。可以與輔料物質組合來制備單劑量形式的活性成分的量一般是產生治療作用的反義寡核苷酸的量。一般而言，以百分之一為單位，該量為約1％至約99％活性成分，優選約5％至約70％，最優選約10％至約30％。

64、在本發明組合物內存在并且在應用于哺乳動物(例如，人)的本發明方法中所用的一種或多種藥物的治療有效量可以由普通技術人員在考慮哺乳動物年齡、體重和狀況的個體差異情況下確定。將本發明的藥物以有效量施用至受試者(例如哺乳動物，如人),所述有銷量是在治療的受試者中產生所需結果(例如，減慢或緩解癌癥或神經變性病)的量。治療有效量可以由本領域技術人員經驗地確定。

65、該患者還可以按每次給藥約0.1至3,000mg每周一次或多次接受藥物(例如，每周2、3、4、5、6或7次或更多次)，每周劑量0.1至2,500(例如，2,000、1,500、1,000、500、100、10、1、0.5、或0.1)mg。患者還可以接受每兩周或三周一次每次給藥0.1至3,000mg的組合物藥物。可以實施包含有效量的本發明組合物的單次或多次施用，劑量水平和樣式由治療醫生選擇。可以基于患者中疾病或病狀的嚴重程度確定并調節劑量和施用方案，其中可以根據臨床醫生常見實施的方法或本發明描述的那些方法在整個治療過程中監測所述嚴重程度。

66、在本發明的又一方面，本發明提出了一種抑制乙型肝炎病毒基因的表達或活性的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：將前述的反義寡核苷酸或前述的藥物組合物與細胞進行接觸。如前所述，前述的反義寡核苷酸可使乙型肝炎病毒的mrna降解，抑制hbv的表達和復制。因此，本發明的方法可用于抑制乙型肝炎病毒基因的表達或活性。例如可于動物體內抑制乙型肝炎病毒基因的表達或活性；或者為非疾病治療目的抑制乙型肝炎病毒基因的表達或活性，例如在體外抑制乙型肝炎病毒基因的表達或活性，以進行后續研究。

67、在本發明的又一方面，本發明提出了一種預防和/或治療乙型肝炎病毒引起的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：向受試者施用藥學上可接受量的前述的反義寡核苷酸或前述的藥物組合物。根據本發明的實施例，該方法可有效預防和/或治療乙型肝炎病毒引起的相關疾病。

68、本發明所述載體、反義寡核苷酸、反義寡核苷酸綴合物的一般合成方法

69、一般地，本發明的載體、反義寡核苷酸、反義寡核苷酸綴合物可以通過本發明所描述的方法制備得到。下面的反應方案和實施例用于進一步舉例說明本發明的內容。

70、下面所描述的實施例，除非其他方面表明，所有的溫度定為攝氏度(℃)。色譜柱使用硅膠柱，硅膠(200-300目)購于青島海洋化工廠，nh2cpg都是購置于河北迪納興科。核磁共振光譜以cdc13、dmso-d6、cd3od或丙酮-d6為溶劑(以ppm為單位)，用tms(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作為參照標準。當出現多重峰的時候，將使用下面的縮寫：s(singlet，單峰)，d(doublet，雙峰)，t(triplet，三重峰)，m(multiplet，多重峰)，br(broadened，寬峰)，dd(doublet?of?doublets，雙二重峰)，dt(doublet?of?triplets，雙三重峰)，br.s(broadened?singlet，寬單峰)，q(四重峰)。偶合常數j，單位用赫茲(hz)表示。

71、低分辨率質譜(ms)數據通過配備g1312a二元泵和a?g1316a?tcc(柱溫保持在30℃)的agilent6320系列lc-ms的光譜儀來測定的，g1329a自動采樣器和g1315b?dad檢測器應用于分析，esi源應用于lc-ms光譜儀。

72、高分辨率質譜(ms)數據通過配備g1311a四元泵和g1316a?tcc(柱溫保持在30℃)的agilent?6130系列lc-ms的光譜儀來測定的，g1329a自動采樣器和g1315d?dad檢測器應用于分析，esi源應用于hr-ms光譜儀。

73、下面簡寫詞的使用貫穿本發明：

74、dcm?二氯甲烷?dmtrcl?4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯

75、tfa?三氟乙酸?tfa三氟乙酸

76、py?吡啶?i-pr?異丙基

77、pe?石油醚?ea?乙酸乙酯

78、tbaf?四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液?hobt?1-羥基苯并三唑

79、acn?乙腈?dmap?4-二甲氨基吡啶

80、ac2o?乙酸酐?mscl?甲磺酰氯

81、boc?叔丁氧羰基?tmsotf?三氟甲磺酸三甲基硅酯

82、meoh?甲醇?thf?四氫呋喃

83、dmso?二甲亞砜?ml?毫升

84、dmf?n,n-二甲基甲酰胺?min?分鐘

85、dcm?二氯甲烷?m,n,mol/l?摩爾/升

86、dipea?n,n-二異丙基乙胺?h?小時

87、tipdscl2?1,3二氯-1,1,3,3-四異丙基二硅氧烷?rt,rt?室溫

88、hbtu?苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽