本發明屬于類器官模型構建，具體涉及一種橫紋肌肉瘤類器官的培養基、構建及培養方法。

背景技術：

1、橫紋肌肉瘤是起源于橫紋肌細胞或向橫紋肌細胞分化的間葉細胞，兒童期最常見的軟組織腫瘤，是一種高度惡性的骨骼肌成肌樣細胞腫瘤，盡管骨骼肌完全分化失敗，但仍有產肌標志物表達。可分為胚胎性橫紋肌肉瘤、腺泡橫紋肌肉瘤和多形性橫紋肌肉瘤、葡萄狀型橫紋肌肉瘤。多發于兒童，成人中極為罕見，患兒中男性少于女性，好發于頭部和頸部區域，根據橫紋肌肉瘤患者年齡、腫瘤大小、病理、臨床分期，可分為低、中和高危3組，進行分層和綜合治療。

2、患者常因腫瘤壓迫而引起疼痛和出血，易發生早期轉移和復發，嚴重影響治療結局和遠期預后。主要治療手段是手術切除伴隨放化療，只有10％的病人的橫紋肌肉瘤能被完全切除，高達37.7％的橫紋肌肉瘤可能會轉移，因此即使對完全切除的病人，化療和放療也是必要的。化療藥物針對人體所有細胞，包括腫瘤細胞和正常細胞，這意味著所用藥物可能對正常細胞產生副作用，大部分副作用在停止用藥后會消失，對于大部分患者是兒童的橫紋肌肉瘤患者來說某些藥物會對腎臟和膀胱產生永久性的損傷，某些永久損害卵巢和睪丸中的細胞，以至很難甚至不能生育。同時復發或轉移的橫紋肌肉瘤患者的5年生存期僅20％，因此，需要優化橫紋肌肉瘤疾病模型，創新治療策略。

3、目前，有30種常用的橫紋肌肉瘤細胞系，大多數細胞系是從治療過的腫瘤或遠處轉移發育而來的，未經治療的腫瘤的細胞系嚴重缺乏，尋求額外的模型系統以更好地研究橫紋肌肉瘤病理生物學至關重要。因此需要能夠捕捉tme復雜性的替代模型來推進相關療法的臨床前研究。這對于尋找新的治療方法、確定對免疫治療有反應的個體以及對患者進行分層具有重要意義。

4、基因分析和組織病理學分析表明，患者來源的腫瘤類器官(pdto)比癌細胞系模型更忠實地保留了原始腫瘤的遺傳多樣性和表型異質性。此外，pdto已成為是模擬人類癌癥、預測體內藥物敏感性和監測腫瘤進展的更可靠的體外模型，除了強大的科研用途，pdto可作為臨床前個性化的試藥替身在患者有限的時間窗口內進行體外高通量藥物篩選，為患者定制最適合的臨床療法，以延長患者的生存周期，提高患者的生存者質量。但橫紋肌肉瘤類器官的構建與培養方案少有報道或構建效率低下。

技術實現思路

1、本發明所要解決的技術問題在于如何解決橫紋肌肉瘤類器官培養所存在的成活率低、形貌差的問題。

2、本發明通過以下技術手段實現解決上述技術問題的：

3、本發明的第一方面提出一種用于培養橫紋肌肉瘤類器官的培養基，包括基礎培養基、基礎成分、特異性因子成分和添加劑成分；

4、所述基礎成分包括如下終濃度的組分：10-30mm?glutamax，50-100u/ml青霉素-鏈霉素，10-25mm?hepes；

5、所述特異性因子成分包括如下終濃度的組分：5-20μg/ml?heparin，50-200ng/mligf1，10-100ng/ml?hgf，30-80ng/ml?fgf-2，20-90μm?a?83-01；

6、所述添加劑成分包括如下終濃度的組分：(1-2)×b27試劑，100-200μg/mlprimocin，(1-2)×n2試劑，1-2mm?n-acetylcysteine，100-200ng/ml?r-spondin?1，10-50ng/ml?egf。

7、說明：

8、heparin可通過阻止蛋白分解性降解和誘導fgf分子寡聚化來穩定生長因子的活性，從而與fgf受體結合形成二聚體并將其激活，在培養系統中添加heparin具有抑制其他雜細胞生長的作用；

9、igf1是一種高度合成代謝與抗分解代謝的化合物，igf1和細胞內的受體結合后表現為刺激細胞生長和抑制細胞死亡的作用，同時在足夠蛋白質存在的情況下可促進新肌肉細胞的生長，提高肌肉細胞的增生能力；

10、hgf具有顯著的促進組織細胞發生、生存和再生，抑制細胞凋亡的作用；

11、hgf與igf1聯合使用可促進mscs成肌化合物的表達；

12、fgf-2在細胞存活、分裂、分化和遷移的調解中發揮重要作用，是組織穩態和癌癥中的關鍵有絲分裂原，可調節多種干細胞類型的自我更新；

13、a?83-01是阻斷smad2磷酸化并抑制tgf-β誘導的上皮-間充質轉化的有效抑制劑。同時抑制smad2磷酸化，以此維持腫瘤干細胞的自我更新和增殖。所以a?83-01在促進細胞增殖，防止細胞分化，維持干細胞干性，抑制細胞凋亡和衰老等方面具有重要作用。

14、優選的，所述基礎培養基為advanced?dmem/f12。

15、優選的，所述添加劑還包括5-30μm?y-27632。

16、本發明的第二方面提出上述培養基的制備方法，包括以下步驟：將基礎成分、特異性因子成分和添加劑成分加入到基礎培養基中，混合均勻，即得。

17、本發明的第三方面提出一種橫紋肌肉瘤類器官的培養方法，包括以下步驟：

18、(1)配制樣本清洗與保存液、樣本消化液，并對橫紋肌肉瘤樣本預處理；

19、(2)制備橫紋肌肉瘤樣本細胞：將橫紋肌肉瘤樣本剪切成肉糜狀小塊，置于樣本消化液中消化，然后用濾網過濾，離心，去上清，收集樣本細胞；

20、(3)將樣本細胞加入至上述培養基中進行培養，即可。

21、優選的，所述樣本清洗與保存液的配制方法為：在dmem培養基中加入2×青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺，10μm?y-27632。

22、優選的，所述樣本消化液的配制方法為：在advaced?dmem/f12中加入膠原蛋白酶ⅳ1mg/ml，1u/ml彈性蛋白酶，0.1mg/ml?dnaseⅰ，10μm?y-27632。

23、優選的，所述橫紋肌肉瘤樣本預處理具體為：采用樣本清洗與保存液對橫紋肌肉瘤樣本進行清洗。

24、優選的，所述濾網為100μm濾網。

25、優選的，步驟(3)中培養的溫度為37℃，每3天更換一次培養基。

26、本發明的有益效果在于：

27、本發明提供了一種橫紋肌肉瘤類器官的培養基、構建與培養方法，可以高效的轉化手術切除的橫紋肌肉瘤組織成橫紋肌肉瘤類器官，構建成功率可高達95％以上，且形貌較好，且得到的橫紋肌肉瘤類器官與其原始手術組織的he染色結果一致。該發明意欲攻破上述技術難題，建立快速有效的橫紋肌肉瘤構建方案，為患者個性化用藥提供助力，為患者疾病研究與藥物研發提供新平臺，具有較好的應用前景。

技術特征：

1.一種用于培養橫紋肌肉瘤類器官的培養基，其特征在于，包括基礎培養基、基礎成分、特異性因子成分和添加劑成分；

2.根據權利要求1所述的用于培養橫紋肌肉瘤類器官的培養基，其特征在于，所述基礎培養基為advanced?dmem/f12。

3.根據權利要求1所述的用于培養橫紋肌肉瘤類器官的培養基，其特征在于，所述添加劑還包括5-30μm?y-27632。

4.權利要求1-3任一項所述的培養基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將基礎成分、特異性因子成分和添加劑成分加入到基礎培養基中，混合均勻，即得。

5.一種橫紋肌肉瘤類器官的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據權利要求5所述的橫紋肌肉瘤類器官的培養方法，其特征在于，所述樣本清洗與保存液的配制方法為：在dmem培養基中加入2×青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺，10μmy-27632。

7.根據權利要求5所述的橫紋肌肉瘤類器官的培養方法，其特征在于，所述樣本消化液的配制方法為：在advaced?dmem/f12中加入1mg/ml膠原蛋白酶ⅳ，1u/ml彈性蛋白酶，0.1mg/ml?dnaseⅰ，10μm?y-27632。

8.根據權利要求5所述的橫紋肌肉瘤類器官的培養方法，其特征在于，所述橫紋肌肉瘤樣本預處理具體為：采用樣本清洗與保存液對橫紋肌肉瘤樣本進行清洗。

9.根據權利要求5所述的橫紋肌肉瘤類器官的培養方法，其特征在于，所述濾網為100μm濾網。

10.根據權利要求5所述的橫紋肌肉瘤類器官的培養方法，其特征在于，步驟(3)中培養的溫度為37℃，每3天更換一次培養基。

技術總結
本發明公開了一種橫紋肌肉瘤類器官的培養基、構建及培養方法，屬于類器官模型構建技術領域。該培養基包括基礎培養基、基礎成分、特異性因子成分和添加劑成分；其中特異性因子成分包括如下終濃度的組分：5?20μg/mL?Heparin，50?200ng/mL?IGF1，10?100ng/mL?HGF，30?80ng/mL?FGF?2，20?90μM?A?83?01。有益效果：本發明提出了一種用于培養橫紋肌肉瘤類器官的培養基，可以高效的轉化手術切除的橫紋肌肉瘤組織成橫紋肌肉瘤類器官，構建成功率可高達95％以上，且得到的橫紋肌肉瘤類器官與其原始手術組織的HE染色結果一致。該發明意欲攻破上述技術難題，建立快速有效的橫紋肌肉瘤構建方案，為患者個性化用藥提供助力，為患者疾病研究與藥物研發提供新平臺，具有較好的應用前景。

技術研發人員：劉海洋,于升,孫潤,蘇芮,黃璘
受保護的技術使用者：合肥綜合性國家科學中心大健康研究院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28