本發(fā)明屬于假病毒合成領(lǐng)域，涉及vsv假病毒，具體涉及一種重組vsv假病毒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水皰性口炎病毒(vesicular?stomatitis?virus，vsv)是一種典型的不分節(jié)段負(fù)鏈rna病毒，屬于水泡性病毒屬，彈狀病毒科。vsv因其廣泛的宿主范圍和在多種哺乳動(dòng)物和昆蟲(chóng)細(xì)胞中強(qiáng)大的復(fù)制特性而被廣泛用于研究病毒進(jìn)入、復(fù)制和組裝。vsv的顯著特性之一是vsv病毒對(duì)于可嵌合病毒包膜的膜蛋白類型沒(méi)有特別的選擇性。細(xì)胞與vsv和其他包膜病毒共感染的研究表明，vsv很容易形成假型，即假病毒將異源病毒的包膜蛋白組裝到vsv膜中。vsv形成假型的能力可能是由于其出芽機(jī)制所致，該機(jī)制已被證明不需要vsv-g蛋白。

2、vsv是一種典型的包膜蛋白動(dòng)物病毒。因?yàn)槠鋸V泛的宿主范圍和強(qiáng)大的復(fù)制能力，被廣泛的應(yīng)用于研究病毒的內(nèi)化、復(fù)制和富集。研究vsv的富集推動(dòng)了重組口炎皰疹病毒重組vsv的發(fā)現(xiàn)，其基本原理是用外源功能基因取代vsv基因組的g蛋白基因。重組vsv-△g可以用來(lái)生成包含異源包膜蛋白的重組vsv假病毒，這些異源蛋白可以是一些生物防護(hù)需求高的病毒蛋白，因?yàn)関sv-△g假病毒的復(fù)制能力被限定于單個(gè)的復(fù)制，因而可以在bsl-2實(shí)驗(yàn)室研究這種bsl-4實(shí)驗(yàn)室要求的病毒。假病毒不但為研究高生物防護(hù)要求的病原體提供了模型，而且在評(píng)價(jià)接種疫苗后中和抗體提供好的平臺(tái)。重組vsv載體疫苗被廣泛用于病毒疫苗的研究、感染后治療的研究，甚至還有能用于治療腫瘤。

3、自1995年對(duì)vsv反向遺傳學(xué)的建立，多種外源基因通過(guò)重組vsv成功表達(dá)。vsv的代表株有indiana株和chandipure株。vsv可感染牛、馬、豬等牲畜，其感染后的主要癥狀有口、蹄和乳頭出現(xiàn)水皰并潰爛。人類在自然狀態(tài)下感染vsv的概率特別小，一般無(wú)明顯癥狀，極個(gè)別會(huì)有類似于輕微感冒的癥狀，因而人體內(nèi)的vsv抗體攜帶比率很低。那些攜帶抗體的人主要集中于vsv的流行地區(qū)和研究vsv的科研工作者還有接觸患病動(dòng)物的獸醫(yī)。人體抗體攜帶率低以及感染vsv對(duì)人體無(wú)影響為vsv作為疫苗載體的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。正常的vsv顆粒是子彈形(65*180nm)，脂質(zhì)體包膜包裹著核糖核蛋白核，基因組全長(zhǎng)大約是11kb，編碼5種主要的病毒蛋白，分別是核蛋白n、磷蛋白p、基質(zhì)蛋白m、包膜糖蛋白g、大聚合酶蛋白l。核蛋白n是表達(dá)最多的病毒蛋白，跟基因組rna緊密結(jié)合形成病毒核衣殼，復(fù)制和翻譯都是以rna為模板。磷蛋白p和聚合酶l組成病毒rna聚合酶，能同時(shí)執(zhí)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。單純的rna或者反轉(zhuǎn)錄的crna都不具備感染能力，基因組rna、核蛋白n、磷酸蛋白p及少量的聚合酶亞單位l，四者緊密結(jié)合，才可形成最小復(fù)制單位。糖蛋白g介導(dǎo)vsv病毒粒子吸附到細(xì)胞膜表面，通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，隨后內(nèi)吞小泡內(nèi)的ph值下降，糖蛋白使病毒囊膜與細(xì)胞膜融合，核衣殼(rnp)被釋放到細(xì)胞漿中。感染病毒粒子內(nèi)包裝的l、n、p共同構(gòu)成的聚合酶復(fù)合物以基因組負(fù)鏈rna為模板啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。vsv作為彈狀病毒科的代表性病毒，在研究病毒顆粒入侵宿主細(xì)胞、辨認(rèn)介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞表面受體、篩選抗病毒藥物以及疫苗開(kāi)發(fā)等方面有著廣泛的應(yīng)用。而對(duì)其進(jìn)行反向遺傳學(xué)是各種應(yīng)用的基礎(chǔ)。而對(duì)于負(fù)鏈rna病毒，從cdna克隆拯救得到感染性病毒面臨著很大挑戰(zhàn)。正鏈rna病毒的rna基因組天然具有感染性，而負(fù)鏈rna病毒需要其基因組被n蛋白正確地包裝后被rna聚合酶識(shí)別并轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒蛋白的mrna。因此，在病毒拯救過(guò)程中，n，p，l蛋白需要通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)提供，這些質(zhì)粒被稱為輔助質(zhì)粒。1992年，wertz實(shí)驗(yàn)室第一次建立了通過(guò)共轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒及帶有vsv基因組2.2kb片段質(zhì)粒的方法，拯救得到具感染性的病毒顆粒，但由于缺乏功能基因，病毒顆粒無(wú)法獨(dú)立復(fù)制。1995年，wertz實(shí)驗(yàn)室及rose實(shí)驗(yàn)室分別獨(dú)立報(bào)道使用表達(dá)vsv全長(zhǎng)基因組的質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒拯救得到可以獨(dú)立復(fù)制的病毒，其通過(guò)在bhk21細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染由t7啟動(dòng)子引導(dǎo)的n，p，l基因及vsv反基因組鏈，同時(shí)通過(guò)共感染表達(dá)t7?rna聚合酶痘病毒，以轉(zhuǎn)錄vsv的反基因組及n，p，l基因，從而成功拯救得到vsv。病毒拯救方法隨后被不斷優(yōu)化，例如建立無(wú)痘病毒拯救系統(tǒng)，即通過(guò)使用cmv啟動(dòng)子引導(dǎo)，或在輔助質(zhì)粒的t7啟動(dòng)子和基因間插入ires序列，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)t7?rna聚合酶的bhk21細(xì)胞系進(jìn)行拯救。

4、2010年michael?a?whitt團(tuán)隊(duì)利用反向遺傳學(xué)原理，通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)在輔助病毒作用下重組生產(chǎn)缺失糖蛋白g的δg-重組vsv病毒，δg-重組vsv病毒感染高表達(dá)糖蛋白g的細(xì)胞后會(huì)自行補(bǔ)齊糖蛋白g，形成結(jié)構(gòu)完整，感染范圍廣且易復(fù)制的重組vsv病毒。該技術(shù)中整個(gè)包裝系統(tǒng)包含六個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)輔助病毒及一株細(xì)胞系；其中五個(gè)關(guān)鍵質(zhì)粒分別為表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白n的質(zhì)粒、表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白磷酸化蛋白質(zhì)p的質(zhì)粒、表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白rna聚合酶l的質(zhì)粒、表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白糖蛋白g的質(zhì)粒以及裝載vsv病毒核酸序列的骨架質(zhì)粒(刪除糖蛋白g基因，替換成常見(jiàn)的報(bào)告基因如綠色熒光蛋白基因egfp、螢火蟲(chóng)熒光素酶基因firefly?luciferase等)；輔助病毒為痘苗病毒；細(xì)胞系為倉(cāng)鼠腎成纖維細(xì)胞bhk-21。在重組vsv病毒包裝時(shí)需要將五個(gè)關(guān)鍵質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染已與輔助痘苗病毒孵育一定時(shí)間的bhk-21細(xì)胞，但只有五個(gè)關(guān)鍵質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)入同一個(gè)已被痘苗病毒感染過(guò)的bhk-21細(xì)胞內(nèi)，才可能在t7?rna聚合酶作用下發(fā)生蛋白表達(dá)、組裝，最終出芽生成δg-重組vsv病毒。這最終導(dǎo)致重組vsv病毒包裝成功的概率極低，且成功生產(chǎn)病毒顆粒的bhk-21細(xì)胞狀態(tài)不佳，產(chǎn)生δg-重組vsv病毒的量極低。為獲得足量的δg-重組vsv病毒需要多次重復(fù)包裝實(shí)驗(yàn)，耗費(fèi)成本高，所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)(whitt,generation?of?vsv?pseudotypes?usingrecombinantδg-vsv?for?studies?on?virus?entry,identification?of?entryinhibitors,and?immune?responses?to?vaccines,2010)。

5、現(xiàn)有技術(shù)cn113717990a公開(kāi)了一種重組vsv假病毒及其制備方法。該技術(shù)用重組表達(dá)t7?rna聚合酶的痘病毒(vv-t7)感染bhk21細(xì)胞，再用已混合好的反向遺傳學(xué)質(zhì)粒(pvsv-dg相關(guān)質(zhì)粒：pbs-n:pbs-p:pbs-g:pbs-l＝5:3:5:8:1)轉(zhuǎn)染已被vv-t7感染過(guò)的bhk21細(xì)胞，12小時(shí)后換液，48小時(shí)后收取含有初代vsv-dg病毒的上清(p0)。p0代病毒可用于進(jìn)一步的擴(kuò)增得到p1代病毒。該技術(shù)缺點(diǎn)為重組vsv假病毒包裝成功的概率低，得到的假病毒滴度低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的重組vsv假病毒包裝成功的效率低的問(wèn)題，提供了一種一種重組vsv假病毒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明先構(gòu)建包裝細(xì)胞、輔助質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒，再將輔助質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒分開(kāi)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程中每次只轉(zhuǎn)染一種質(zhì)粒，得到的細(xì)胞再轉(zhuǎn)染下一種質(zhì)粒，經(jīng)多次轉(zhuǎn)染后收獲重組vsv假病毒，還通過(guò)繼續(xù)轉(zhuǎn)染表達(dá)病毒外膜蛋白的細(xì)胞株進(jìn)行假病毒擴(kuò)增。后期包裝δg-vsv病毒時(shí)成功率高，得到的假病毒滴度高，明顯降低了實(shí)驗(yàn)重復(fù)率；轉(zhuǎn)染過(guò)程中得到的中間細(xì)胞株可凍存起來(lái)，復(fù)蘇后直接用于包裝，無(wú)需重復(fù)構(gòu)建過(guò)程。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種重組vsv假病毒的制備方法，所述制備方法為依次向細(xì)胞株中轉(zhuǎn)入輔助質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒；所述輔助質(zhì)粒包括：包裝水泡性口炎病毒的必要蛋白n蛋白、p蛋白、g蛋白和l蛋白，所述骨架質(zhì)粒包括報(bào)告基因和水皰性口炎病毒基因組。

4、優(yōu)選地，所述制備方法包括以下步驟：

5、s1、包裝細(xì)胞構(gòu)建：構(gòu)建表達(dá)噬菌體t7?rna聚合酶的細(xì)胞株；

6、s2、輔助質(zhì)粒構(gòu)建：構(gòu)建含有病毒外膜蛋白編碼基因的輔助質(zhì)粒，命名為p-x；構(gòu)建含有vsv病毒的n蛋白編碼基因的輔助質(zhì)粒，命名為p-n；構(gòu)建含有vsv病毒的p蛋白編碼基因的輔助質(zhì)粒，命名為p-p；構(gòu)建含有vsv病毒的l蛋白的編碼基因的輔助質(zhì)粒，命名為p-l，共4種輔助質(zhì)粒；

7、s3、骨架質(zhì)粒構(gòu)建：構(gòu)建含vsv病毒基因組的骨架質(zhì)粒，所述vsv病毒基因組中不含g蛋白編碼基因；

8、s4、重組vsv假病毒制備：將步驟s2中4種輔助質(zhì)粒和步驟s3中骨架質(zhì)粒分開(kāi)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，且每次只轉(zhuǎn)染一種質(zhì)粒，得到的細(xì)胞再轉(zhuǎn)染下一種質(zhì)粒，經(jīng)五次轉(zhuǎn)染后收獲重組vsv假病毒；

9、s5、重組vsv假病毒擴(kuò)增：將收獲的重組vsv假病毒轉(zhuǎn)染已經(jīng)表達(dá)病毒外膜蛋白的細(xì)胞，且所述病毒外膜蛋白與步驟s2中病毒外膜蛋白相同。

10、優(yōu)選地，步驟s1中所述細(xì)胞株為哺乳動(dòng)物細(xì)胞株，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞株包括bhk21細(xì)胞株、hek293細(xì)胞株、hela細(xì)胞株或vero細(xì)胞株。

11、具體地，步驟s1中所述細(xì)胞株為bhk-21細(xì)胞株。

12、優(yōu)選地，步驟s2中所述病毒外膜蛋白包括vsv病毒g蛋白、hpv病毒外膜蛋白、hiv病毒外膜蛋白或sars病毒外膜蛋白。

13、具體地，步驟s2中所述病毒外膜蛋白為vsv病毒g蛋白。

14、優(yōu)選地，步驟s3中所述骨架質(zhì)粒還包含報(bào)告基因，所述報(bào)告基因包括熒光蛋白和熒光素酶的基因。

15、優(yōu)選地，所述熒光蛋白包括gfp、rfp、yfp或bfp，所述熒光素酶包括熒火蟲(chóng)熒光素酶、gaussia熒光素酶、海腎熒光素酶或納米熒光素酶酶。

16、具體地，所述熒光蛋白為gfp，所述熒光素酶為熒火蟲(chóng)熒光素酶。

17、優(yōu)選地，所述步驟s2和步驟s3中的質(zhì)粒還包含啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包括t7啟動(dòng)子、cmv啟動(dòng)子或cbv啟動(dòng)子。

18、具體地，所述步驟s2中質(zhì)粒包含t7啟動(dòng)子，且所述步驟s3中質(zhì)粒包含cmv啟動(dòng)子。

19、優(yōu)選地，所述步驟s4包括以下步驟：

20、用輔助質(zhì)粒p-p轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，得到細(xì)胞cell-p；用輔助質(zhì)粒p-l轉(zhuǎn)染細(xì)胞cell-p，得到細(xì)胞cell-p-l；用輔助質(zhì)粒p-n轉(zhuǎn)染細(xì)胞cell-p-l，得到細(xì)胞cell-p-l-n；用輔助質(zhì)粒p-x轉(zhuǎn)染細(xì)胞cell-p-l-n，得到細(xì)胞cell-p-l-n-x；用骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞cell-p-l-n-x，得到重組vsv假病毒。

21、優(yōu)選地，所述步驟s5包括將步驟s4收獲的重組vsv假病毒轉(zhuǎn)染上述的細(xì)胞cell-p-l-n-x。

22、另一方面，本發(fā)明提供了一種上述制備方法制備的重組vsv假病毒。

23、另一方面，本發(fā)明提供了上述制備方法或上述重組vsv假病毒在制備疫苗或藥物中的應(yīng)用。

24、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

25、1、不需要對(duì)常見(jiàn)輔助質(zhì)粒進(jìn)行改造，只需通過(guò)不同重復(fù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的過(guò)程，構(gòu)建一株細(xì)胞株，且轉(zhuǎn)染過(guò)程均可六孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)完成，所需的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染溶劑、轉(zhuǎn)染試劑及細(xì)胞培養(yǎng)所需的試劑都極少，無(wú)明顯成本增加；

26、2、后期包裝δg-vsv病毒時(shí)成功率高，得到的假病毒滴度高，明顯降低了實(shí)驗(yàn)重復(fù)率；

27、3、轉(zhuǎn)染過(guò)程中得到的中間細(xì)胞株可凍存起來(lái)，復(fù)蘇后直接用于包裝，無(wú)需重復(fù)構(gòu)建過(guò)程。構(gòu)建的細(xì)胞株同時(shí)適用于包裝基于vsv病毒的病毒糖蛋白替換成其它病毒外膜蛋白的假型病毒。