本發明涉及生物中的癌癥診斷和治療領域，具體地，涉及一種生物素化吉非替尼探針及其制備方法和應用。

背景技術：

1、表皮生長因子受體(egfr)在細胞的增殖、分化、遷移和存活等過程中發揮關鍵作用。egfr在許多腫瘤細胞表面過度表達或發生突變，導致其酪氨酸激酶活性異常升高，持續激活下游的信號通路，如ras-raf-mek-erk和pi3k-akt-mtor等，促進腫瘤細胞的生長和存活。吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(egfr-tki)，能夠競爭性地結合到egfr的atp結合位點，從而抑制egfr酪氨酸激酶的自身磷酸化，阻斷下游信號通路的激活，起到抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制血管生成和侵襲轉移等多種抗腫瘤作用。此外，吉非替尼也可與其他治療方法聯合使用，比如與化療藥物聯合，通過不同的作用機制協同抑制腫瘤生長；或者與放療聯合，增強放療對腫瘤細胞的殺傷作用。

2、吉非替尼主要用于攜帶有egfr突變的晚期或轉移性非小細胞肺癌的治療。對于攜帶有egfr敏感突變(如19號外顯子缺失突變、21號外顯子l858r點突變等)的非小細胞肺癌患者，吉非替尼表現出良好的治療效果。臨床上，吉非替尼用藥標準主要依據患者的egfr基因檢測結果。egfr基因檢測并不能定量檢測egfr酪氨酸激酶被抑制的水平，因此無法精準評估非小細胞肺癌患者對吉非替尼藥物治療的有效性。設計吉非替尼探針可以在體外精準地檢測探針與腫瘤細胞egfr的結合情況，推測egfr酪氨酸激酶被抑制的水平，進而預測非小細胞肺癌患者對吉非替尼治療的可行性及有效性。目前，專利cn104212440a公開了一類喹唑啉類熒光探針及其制備和應用，具體為將熒光發色基團和吉非替尼相連，制備得到一種熒光探針，該熒光探針由于吉非替尼的靶向作用，可用于探究探針與egfr的結合情況，應用于細胞中生物標志物egfr的相對定量檢測，為癌癥診斷提供更為直接的信息，同時該探針能有效抑制egfr酪氨酸激酶活性，兼具癌癥治療功能。但由于熒光素的最適發光和保存的ph通常在7.0～9.0之間，腫瘤組織由于warburg效應的存在常常呈現酸性，即腫瘤細胞在有氧情況下仍主要依賴糖酵解來獲得能量，產生大量乳酸，導致ph值下降，在實際檢測中不利于熒光素標記探針的使用；且使用激發光對探針進行檢測時，由于探針本身含有熒光標記，會在檢測過程中造成背景干擾，導致檢測結果的不準確性。因此，提供一種穩定性、靈敏度和準確性更高，且適用于多種情況下的檢測的吉非替尼探針具有重要意義。

技術實現思路

1、本發明的目的在于克服現有技術中存在的上述缺陷和不足，提供一種生物素化吉非替尼探針。

2、本發明的第二個目的在于提供上述生物素化吉非替尼探針的制備方法。

3、本發明的第三個目的在于提供上述探針在制備癌癥治療或診斷的產品中的應用。

4、本發明的第四個目的在于提供上述探針在制備指導癌癥患者吉非替尼用藥的產品中的應用。

5、本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

6、本發明提供一種生物素化吉非替尼探針，其結構式如式(ⅰ)所示，

7、

8、吉非替尼主要用于攜帶有egfr突變的晚期或轉移性非小細胞肺癌的治療。對于攜帶有egfr敏感突變(如19號外顯子缺失突變、21號外顯子l858r點突變等)的非小細胞肺癌患者，吉非替尼表現出良好的治療效果。而生物素因與親和素之間存在特異性強、親和力高的相互作用，利用熒光標記的鏈霉親和素對生物素標記的吉非替尼探針進行標記時，即使可以與吉非替尼結合的突變類型低，也能通過鏈霉親和素-生物素反應被放大，增加檢測的靈敏度，且生物素化吉非替尼探針本身不含熒光，在檢測過程中不會引起背景干擾，靈敏度和準確性更高。同時，鏈霉親和素可通過結合多種標記物(如酶、熒光染料等)，不僅適用于多種類型的實驗(如免疫組化、western?blot、elisa等)還可適用于多種檢測系統(如hrp、ap以及熒光檢測系統等)，確定吉非替尼靶向位置和egfr是否共定位，提高檢測準確性。因此，生物素化吉非替尼探針因其穩定性更好、靈敏度和準確性高、能夠長期保存，可用于需要長時間保存和多次分析的實驗中；可用于多種情況下檢測吉非替尼與egfr的結合情況，對癌癥進行診斷；結合基因測序確定egfr突變類型，還可評估吉非替尼對該egfr突變類型治療的可行性和有效性，指導用藥。

9、本發明還提供上述生物素化吉非替尼探針的制備方法，包括以下步驟：

10、s1.將吉非替尼進行甲氧基脫甲基反應，得到原料；所述原料為

11、

12、s2.將原料和生物素進行酯化反應，即得式(ⅰ)所示生物素化吉非替尼探針。

13、本發明首先將吉非替尼進行甲氧基脫甲基反應，使其苯環上的甲氧基(-och3)轉化為羥基(-oh)后，再將反應產物與生物素進行酯化反應，制備得到生物素化吉非替尼探針。

14、進一步地，所述步驟s1中甲氧基脫甲基反應為在有機溶劑中采用氯化鋁作為脫甲基試劑進行反應，并調節ph為堿性，純化得到。

15、更進一步地，所述有機溶劑為二氯乙烷、乙腈或二氯甲烷等。。

16、更進一步地，反應的溫度為58～62℃。

17、更進一步地，所述純化為二氯甲烷/甲醇過柱純化。

18、進一步地，所述步驟s2中原料與生物素的質量比為40～45:28～30。

19、優選地，所述步驟s2中原料與生物素的質量比為432:293。

20、進一步地，所述步驟s2中酯化反應為在有機溶劑中采用碳化二亞胺與1-羥基苯并三唑進行反應。

21、更進一步地，所述有機溶劑為n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。

22、臨床上，吉非替尼用藥標準主要依據患者的egfr基因檢測結果。目前的egfr基因檢測集中在已知的19號外顯子的缺失突變和21號外顯子l858r點突變等。然而，egfr基因是還存在許多其他少見的突變類型，這些少見突變對吉非替尼的敏感性無法通過基因檢測有效的進行評估，從而導致無法全面評估吉非替尼的治療有效性。在實際治療中，仍有攜帶其他egfr突變(非19號外顯子缺失突變或21號外顯子l858r點突變)的患者能夠從吉非替尼治療中獲益，不同患者對吉非替尼治療的有效性存在差異，其根本原因是吉非替尼與靶向egfr結合能力的差異。因此，吉非替尼和egfr的結合能力才是評價治療有效性的關鍵。生物素化吉非替尼探針可以在進行基因測序確定egfr突變類型的同時，使用生物素化吉非替尼探針在蛋白水平檢測egfr的活性狀態，綜合判斷患者是否適合吉非替尼治療以及預測治療效果，為患者提供更加精準的治療方案。因此，生物素化吉非替尼探針有望成為精準醫療中不可或缺的工具，使更多患者從吉非替尼治療中獲益。

23、因此，本發明提供上述生物素化吉非替尼探針在制備癌癥治療或診斷的產品中的應用。

24、本發明還提供上述生物素化吉非替尼探針在制備指導癌癥患者吉非替尼用藥的產品中的應用。

25、進一步地，所述產品為通過檢測探針靶向表皮生長因子受體的能力確定患者吉非替尼用藥。

26、進一步地，所述癌癥為表皮生長因子受體過表達或突變導致的癌癥。

27、優選地，所述癌癥為非小細胞肺癌。

28、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

29、本發明提供一種生物素化吉非替尼探針及其制備方法和應用，本發明所述探針因其穩定性更好、靈敏度和準確性高、能夠長期保存，可用于需要長時間保存和多次分析的實驗中，可以用于多種情況下檢測吉非替尼與egfr的結合情況，對癌癥進行診斷，結合基因測序確定egfr突變類型，還可評估吉非替尼對該egfr突變類型治療的可行性和有效性，指導用藥。因此，生物素化吉非替尼探針有望成為精準醫療中不可或缺的工具，使更多患者從吉非替尼治療中獲益。