本發明屬于生物，涉及細胞衰老模型的構建方法及其應用。

背景技術：

1、當細胞失去復制能力，進入不可逆的增殖停滯狀態，就稱為細胞衰老(cellsenescence)，又稱復制衰老(replicative?senescence，rs)。細胞衰老是對壓力和損傷的一種反應，會隨著年齡的增長而增加。衰老細胞(senescent?cell)進入永久性生長停滯狀態，并釋放衰老相關分泌表型(senescence-associated?secretory?phenotype)。細胞衰老在調節胚胎發育、傷口愈合、纖維化消退和腫瘤抑制方面具有有益的生物學功能。然而，長期衰老可能導致有害的后遺癥，包括腫瘤發展、慢性炎癥、免疫缺陷和干細胞衰竭。由于觀察到細胞衰老在骨質疏松癥、代謝綜合征、2型糖尿病、癌癥、生殖衰老、動脈粥樣硬化、神經退行性疾病、青光眼和慢性腎病等慢性疾病的發病機制中發揮重要作用，人們對細胞衰老和衰老調節干預措施的興趣日益濃厚。

2、目前已知兩種誘導細胞衰老的方式：復制性衰老和應激誘導性過早衰老。第一種情況下，細胞衰老是由重復增殖后的端粒磨損引起的；第二種情況下，細胞衰老是由亞毒性劑量的外在或內在刺激引起的，如輻射、氧化應激、藥物和致癌應激(doi:10.1016/j.cell.2019.10.005)。然而，第一種細胞衰老模型構建方式主要用于原代細胞，耗時長。第二種氧化應激處理等方式會產生短期衰老表型，導致細胞在幾天內快速凋亡和死亡，并且很容易引發細胞凋亡而不是細胞衰老。單一類型的衰老細胞模型往往只能模擬衰老過程中的部分特征，如h2o2處理細胞主要模擬的是衰老過程中氧化應激導致的dna損傷，而無法反映細胞衰老全過程。

技術實現思路

1、針對上述問題，本發明的首要目的是提供一種簡單穩定快速且能夠反映衰老過程的細胞衰老模型的構建方法。具體涉及將細胞完全培養基中的胚胎期動物血清替換為新生期動物血清、成年期動物血清，在這種體系下培養細胞3-10天，用于誘導細胞衰老。

2、為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

3、配制以下三組培養基：基礎培養基+胚胎期動物血清、基礎培養基+新生期動物血清、基礎培養基+成年期動物血清。第一組為對照組，第二組和第三組為造模組。細胞在胚胎期動物血清完全培養基下培養至對數生長期時進行傳代，接種細胞前按上述三個實驗組別更換培養基成分。培養細胞3-10天后，觀察細胞狀態，與胚胎期動物血清組相比，新生期動物血清和成年期動物血清組細胞生長變慢，細胞變得大而扁平。通過sa-β-gal染色法和qpcr檢測衰老相關基因確定細胞衰老。

4、所述細胞的來源為人源或鼠源，人源的細胞為人間充質干細胞和人永生化角質細胞，鼠源的細胞為小鼠成肌細胞和小鼠胚胎成骨細胞。

5、所述細胞選擇小鼠成肌細胞，培養基選用dmem、雙抗、新生期動物血清，或者選用dmem、雙抗、成年期動物血清。

6、所述細胞選擇小鼠胚胎成骨細胞，培養基選用memα、雙抗、新生期動物血清，或者選用memα、雙抗、成年期動物血清。

7、所述細胞選擇人間充質干細胞，培養基選用dmem、雙抗、l-谷氨酰胺、新生期動物血清，或者選用dmem、雙抗、l-谷氨酰胺、成年期動物血清。

8、所述細胞選擇人永生化角質細胞，培養基選用dmem、雙抗、新生期動物血清，或者選用dmem、雙抗、成年期動物血清。

9、本發明還提出一種細胞衰老模型，采用上述的構建方法構成。

10、本發明還提出上述的細胞衰老模型在細胞衰老緩解和/或防治藥物篩選中的應用。

11、本發明方法構建的新生期動物血清或成年期動物血清誘導細胞衰老模型的優點有：(1)相對于對細胞進行輻射和氧化應激等操作，該細胞衰老模型操作簡便，新生期動物血清和成年期動物血清易于獲取，且新生期動物血清和成年期動物血清誘導細胞衰老的過程與細胞完全培養基培養細胞的方式相似，過程簡單；(2)新生期動物血清和成年期動物血清誘導的細胞衰老模型體外模擬了不同年齡段機體衰老的過程，突破了氧化應激處理產生細胞衰老表型的局限性。

技術特征：

1.一種細胞衰老模型的構建方法，其特征在于，首先細胞在胚胎期動物血清完全培養基下培養至對數生長期時進行傳代，然后分別用胚胎期動物血清、新生期動物血清或成年期動物血清完全培養基接種細胞，進行培養，觀察細胞狀態，與胚胎期動物血清組比，新生期動物血清或成年期動物血清組細胞生長變慢，細胞變得大而扁平，通過sa-β-gal染色以及檢測衰老相關基因的轉錄水平，確定細胞衰老，證明細胞衰老模型構建成功。

2.根據權利要求1所述的細胞衰老模型的構建方法，其特征在于，細胞培養時間為3-10天。

3.根據權利要求1所述的細胞衰老模型的構建方法，其特征在于，所述細胞的來源為人源或鼠源，人源的細胞為人間充質干細胞和人永生化角質細胞，鼠源的細胞為小鼠成肌細胞和小鼠胚胎成骨細胞。

4.根據權利要求3所述的細胞衰老模型的構建方法，其特征在于，所述細胞選擇小鼠成肌細胞，完全培養基選用dmem、雙抗、新生期動物血清，或者選用dmem、雙抗、成年期動物血清。

5.根據權利要求3所述的細胞衰老模型的構建方法，其特征在于，所述細胞選擇小鼠胚胎成骨細胞，完全培養基選用memα、雙抗、新生期動物血清，或者選用memα、雙抗、成年期動物血清。

6.根據權利要求3所述的細胞衰老模型的構建方法，其特征在于，所述細胞選擇人間充質干細胞，完全培養基選用dmem、雙抗、l-谷氨酰胺、新生期動物血清，或者選用dmem、雙抗、l-谷氨酰胺、成年期動物血清。

7.根據權利要求3所述的細胞衰老模型的構建方法，其特征在于，所述細胞選擇人永生化角質細胞，完全培養基選用dmem、雙抗、新生期動物血清，或者選用dmem、雙抗、成年期動物血清。

8.一種細胞衰老模型，其特征在于，采用權利要求1-7任一項所述的構建方法構成。

9.權利要求8所述的細胞衰老模型在細胞衰老緩解和/或防治藥物篩選中的應用。

技術總結
本發明公開了細胞衰老模型的構建方法及其應用，屬于生物技術領域，首先細胞在胚胎期動物血清完全培養基下培養至對數生長期時進行傳代，然后分別用胚胎期動物血清、新生期動物血清或成年期動物血清完全培養基接種細胞，培養并觀察細胞狀態，與胚胎期動物血清組比，新生期動物血清或成年期動物血清組細胞生長變慢，細胞變得大而扁平，通過SA?β?gal染色以及檢測衰老相關基因的轉錄水平，確定細胞衰老，證明細胞衰老模型構建成功。該細胞衰老模型操作簡便，且誘導衰老的過程簡單穩定快速；新生期動物血清和成年期動物血清誘導的細胞衰老模型體外模擬了不同年齡段機體衰老的過程，突破了氧化應激處理產生細胞衰老表型的局限性。

技術研發人員：劉麗君,王欣然
受保護的技術使用者：東北大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24