本發明涉及生物催化，尤其涉及sam類似物及其應用。

背景技術：

1、以甲基化為代表的烴基化反應會提高被修飾分子的生物活性或選擇性，從而提高這些化合物的靶向性、安全性甚至生理效應，這在制藥和農業工業中是一種廣泛使用的策略，通過調整它們的結合親和力，溶解度和代謝譜來改善候選藥物和天然產物的藥理學特性。目前，烴基化越來越成為藥物結構修飾與改造的重要策略之一。

2、氟是一種獨特的化學元素，具有最大的電負性和除氫外最小的原子半徑，將烴基中的氫替換成氟，幾乎不會影響其大小和形狀，因此不會給催化系統帶來空間上的負荷，但卻極大的影響了分子的物理化學性質，如極性、酸堿性、偶極距、細胞滲透性、親脂性以及穩定性等等。由于氟原子賦予分子獨特的性質，在藥物化學、農用化學和材料化學中具有重要作用。尤其是在藥物中引入氟元素，可以提高生物利用度、增加對靶器官的選擇性、降低藥物的使用劑量，這些特殊的性質促進了含氟藥物的快速發展，近年來對于氟化學的研究也日趨增多。氟存在于20-30％的藥品和大約30％的農用化學品中，目前高端特種材料中近一半為含氟材料。因此，設計和開發含有氟原子或含氟官能團的各種化合物具有十分重要的研究價值，在化合物分子中的特定位置選擇性地引入氟原子或含氟官能團更是目前合成含氟藥物和含氟活性化合物的關鍵。

3、近年來，在傳統的烴基化修飾基礎上，進一步加強了對氟烴基化的研究。傳統的合成烴基化方法有幾個缺點，其反應底物對環境不友好(如烴基鹵化物)，以及缺乏強大的區域選擇性、化學選擇性或立體選擇性，在合成過程中往往能耗高，收率低。這些化學合成中固有的缺陷，對于進一步研究廣泛的烴基化尤其是氟烴基化反應帶來了挑戰。同時，由于氟化試劑的缺失，也對氟烴基化研究的發展帶來了限制。

4、與化學反應相比，生物催化反應具有選擇性高、環境友好、反應條件溫和等優點。隨著生物催化劑的不斷發現和酶催化領域的快速發展，利用酶催化替代傳統的化學合成逐漸成為制藥領域的顯著趨勢。對于酶催化的烴基化研究受啟發于生物體自身天然的甲基化反應，即以輔因子s-腺苷-l-甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine,sam)作為甲基供體，sam依賴的甲基轉移酶(mtases)利用sam將許多分子甲基化，包括體內小分子代謝物、脂肪、蛋白質、dna、rna等。反應機理涉及親核試劑對sam親電甲基取代基的極性sn2攻擊，并生成s-腺苷同型半胱氨酸(sah)作為副產物。sam以及sam依賴的mtases是自然界中應用最廣泛的生物催化系統，mtases在自然界中普遍存在，并且在體外已證明其具有廣泛的底物范圍。近年來，對于sam類似物(如將甲基替換為乙基、丙基、芳基或其他長鏈烴基等)的研究拓寬了這一生物催化系統的底物寬泛性和功能多樣性，也為利用該策略進行氟烴基化反應帶來了機遇與挑戰。

5、

6、由于sam及其類似物特殊的锍鎓結構使其存在固有的化學不穩定性。在ph?7.5-10.0和37℃條件下，以三種不同的方式降解。它在硫的作用下發生外消旋，形成非對映體(r,s)。在ph值高于3時，它經歷分子內環化生成5’-脫氧-5’-甲硫腺苷(mta)和l-高絲氨酸內酯，這是sam極其類似物分解的主要途徑。當ph值高于7時，它在c5’處發生去質子化，導致腺嘌呤的消除和s-核糖基甲硫氨酸的產生。

7、

8、鹵化物甲基轉移酶(halide?methyltransferase,hmt),是一類可以直接催化鹵代烷烴試劑和sah產生sam及其類似物的酶，不同來源的hmt催化轉移烴基的能力不同，尤其對于比甲基體積更大的非天然官能團。chen等人研究了來自aspergillus?fungus種屬的aclhmt的結構(chen?q,et?al.mol.catal.2023,550,113533.),并構建了三種突變體(w27f，w27f/p8l,w27f/p8l/v265w)來增強其對s-腺苷-l-乙硫氨酸(sae)形成的催化活性。這三種突變體的活性都高于野生型的aclhmt，尤其是w27f/p8l/v265w，它催化形成sae的活性是野生型的38.7倍。seebeck等人發現hmt可以從氟甲基碘化物(fmei)和sah生成s-腺苷-s-(氟甲基)-l-同型半胱氨酸(f-sam)(seebeckf?p,et?al.angew.chem.int.ed.2021,60,27178–-27183)，但并未對其進行表征和鑒定。因為在生理條件下，f-sam非常不穩定，快速水解為l-高絲氨酸內酯和5’-脫氧-5’-氟甲硫腺苷(f-mta)，實驗發現f-mta仍舊不穩定，會繼續分解為5’-脫氧-5’-硫代腺苷，甲醛和氟化物。這和天然sam的分解模式不完全相同，其水解為mta的速度更快，并且在水解為mta的基礎上進一步分解，這可能是引入氟原子后造成的。為了克服f-sam的不穩定性達到氟甲基化親核試劑的目的，他們創新性地采用了hmt-mtases級聯反應體系，利用二級甲基轉移酶將原位生成的f-sam的氟甲基轉移到n-、c-、o-等親核試劑上。這種反應策略在他們之前的研究中就報導過(seebeckf?p,etal.nat.catal.2019,2,696-701)，證明了c-，n-和o-特異性mtases可以與hmt結合形成酶級聯，只需要催化濃度的sam，并使用甲基碘化物(mei)作為化學計量甲基供體。這成功地克服了sam固有的不穩定性，并且提高了原子經濟性和反應效率。

9、除了氟甲基外，其他含氟官能團的sam類似物也具有重要的研究價值。liu等人使用相應的sam類似物將3,3-二氟烯基和幾個含氟芐基轉移到萬古霉素上(liuw,etal.org.lett.2023,25,5650-5655)，這些類似物是由工程化的人源甲硫氨酸腺苷轉移酶(hmat2a)與mtase偶聯制備的。他們也嘗試利用相同的策略合成氟乙基sam(fet-sam)并進行氟乙基轉移，但沒有檢測到氟乙基化的產物，只檢測到了微量的羥乙基化萬古霉素，這表明了利用sam類似物實現氟乙基化具有比較大的挑戰。但氟乙基是一個重要的藥效官能團，含氟乙基藥物是具有抗敏感、抗炎等多種活性的重要藥物，用于治療鼻炎、支氣管炎、哮喘等疾病。許多含的氟乙基的藥物是pet-ct的診斷藥物。此外，含氟乙基的19f探針在大型膜蛋白結構動力學的核磁共振研究中發揮著重要作用。因此，對氟乙基化反應的探究具有重要的研究意義。然而，現在的研究對于酶促合成含氟官能團的活性藥物類似物尚少，氟乙基作為一種重要的含氟官能團，目前還沒有酶促合成相關類似物的研究。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發明提供一種sam類似物和sam依賴型甲基轉移酶突變體，并構建基于氟烴基sam類似物的hmt-mtase環酶級聯反應體系。本發明提供的fet-seam和fet-sam可以利用mtases對活性分子進行氟乙基轉移反應。其中，fet-seam能夠成功地避免氟乙基消除問題，更適宜用作多種mtases酶促氟乙基化反應的氟乙基供體。進一步的，本發明通過環酶級聯反應原位生成fet-seam的方式，減少了自身的分解，提高了反應效率。更進一步的，使用sam依賴型甲基轉移酶突變體用于活性分子的氟乙基化修飾，相比野生型甲基轉移酶及其他轉移酶突變體明顯提高了氟乙基化反應產物的收率。

2、為達到以上目的，本發明采用的技術方案如下：

3、sam依賴型甲基轉移酶的突變體，其包括i6v、l160a、l160v、l160i、l160s中的一種或兩種以上的突變位點，其野生型的氨基酸序列如genbank:aaa26712.1或genbank:aaf67508.2所示。

4、一些實施方案中，所述突變體為洋紅霉素4-o-甲基轉移酶dnrk突變體，其突變位點為l160a、l160v、l160i或l160s，其野生型的氨基酸序列如genbank:aaa26712.1所示。

5、一些實施方案中，所述突變體為香豆素c-甲基轉移酶novo突變體，其突變位點為i6v，其野生型的氨基酸序列如genbank:aaf67508.2所示。

6、實驗表明，相比野生型甲基轉移酶，本發明提供的上述突變體明顯提高了氟乙基化反應產物的收率。

7、本發明還提供了生物材料，包括：

8、1)編碼本發明所述突變體的核酸；

9、2)包含1)所述核酸的表達盒；

10、3)包含1)所述核酸或2)所述表達盒的重組載體；

11、4)轉染或轉化3)所述重組載體的宿主。

12、本發明所述的突變體可以由化學合成法獲得，也可通過生物合成法獲得，所述生物合成法包括：構建本發明4)所示的宿主，培養，獲得突變體。采用表達

13、本發明還提供了氟烴基sam類似物，其具有式ⅰ所示結構：

14、

15、其中，x為硫或硒；

16、r為氟取代的c2～c10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基。

17、一些實施方案中，所述c2～c10飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基等。

18、一些具體實施例中，所述sam類似物具有如下任一所示結構：

19、

20、本發明合成兩種新的sam類似物，fet-sam和fet-seam，這兩種化合物都可以通過化學法合成并分離得到純品，同時也可以由hmt酶促反應得到，但是在酶反應體系條件下，發生不同程度的分解。

21、本發明證明了hmt生成fet-sam和fet-seam的能力，通過使用hmt原位生成fet-seam，創建了基于seah的hmt-mtase環酶級聯反應，并成功地實現了o-，n-，s-和c-親核試劑的酶促氟乙基化。

22、本發明還提供了sam類似物作為受體底物氟烴基化的供體的應用。

23、所述受體底物為本領域常見的活性分子藥物，包括但不限于蛋白、核酸或小分子化合物等，本發明的具體實施例中為洋紅霉素、香豆素。

24、本發明還提供了對受體底物進行酶促氟烴基化的方法，將sam類似物和受體底物在本發明所述突變體的催化作用下進行反應，得到氟烴基化的受體產物。

25、進一步的，所述sam類似物為本發明式i所示的sam類似物。

26、本發明還提供一種氟烴基化的環酶級聯反應，在同一體系中同時進行步驟1～2)：

27、1)通過鹵素甲基轉移酶催化式ii所示的sah類似物與氟烴基碘代試劑進行反應生成式i所示的sam類似物；

28、

29、2)式i所示的sam類似物與受體底物在甲基轉移酶的作用下反應，獲得氟烴基化的受體產物和式ii所示的sah類似物；

30、其中，步驟2)獲得式ii所示的sah類似物循環用于步驟1)的反應；

31、所述氟烴基碘代試劑中的烴基為c2～從c10的直鏈或支鏈烴基。

32、一些優選實施方案中，所述sam依賴型甲基轉移酶為本發明所述的突變體。

33、本發明中，所述鹵素甲基轉移酶優選為鹵素甲基轉移酶突變體。一些具體實施例中，具體為aclhmt(w27f/p8l或者w27f/p8l/v265w)突變體。

34、本發明基于蛋白結構分析，對mtases進行改造，獲得了五種sam依賴型甲基轉移酶突變體dnrkl160a、dnrkl160v、dnrkl160i、dnrkl160s、novo?i6v，并設計合成了新的氟乙基供體——式i所示的sam類似物(如fet-sam和fet-seam)。實驗結果顯示，本發明提供的突變體可以參與hmt-mtase環酶級聯反應用于活性分子的氟乙基化修飾，明顯提高了氟乙基化產物的收率，本發明提供的sam類似物fet-seam成功地避免了fet-sam的氟乙基消除問題，穩定性較高，滿足利用mtases進行氟乙基轉移反應的條件。結果表明，本發明提供的sam類似物及sam依賴型甲基轉移酶適用于活性分子的氟乙基化修飾，與現有的化學法合成法相比，酶促反應操作簡便，反應條件溫和、環保，同時環酶級聯反應通過循環再生氟乙基供體fet-seam或fet-sam，大大提高了原子經濟性和反應效率。為制備藥物氟乙基類似物提供了新的途徑。