本發明涉及微生物，具體涉及一株高耐受酚醛抑制物的釀酒酵母及其高抗逆的關鍵基因和應用。

背景技術：

1、木質纖維素如玉米秸稈、水稻秸稈等是儲量最大的生物質資源，屬于一類可再生資源，具有替代化石能源的巨大潛力。據估計，全球木質纖維素資源總量高達1800億噸。然而，木質纖維素具有生物頑抗性，難以被纖維素酶及微生物快速降解，而預處理過程能夠有效破壞木質纖維素的頑抗結構，但這一過程不可避免地會產生一些后續纖維素酶酶解及發酵微生物生物活性的抑制物。其中木質素來源的酚類抑制物由于其水溶性較差、成分復雜、毒性較大，難以有效地從預處理后的原料中去除，包括酚醛、酚酸以及酚醇，這三種抑制物按照毒性大小順序依次為酚醛、酚酸和酚醇。

2、常規的抑制物脫除方法包括過堿中和、水洗、活性炭吸附和生物脫毒等。但是，這些方法在脫除抑制物的同時，還可能伴隨著大量廢水產生、副產物產生及可發酵性糖損失等問題；酚類抑制物水溶性較差，生物降解效率低，在脫毒之后仍會有大量的酚類抑制物保留，會對后續的微生物發酵造成嚴重的影響。為了解決抑制物的影響，公開號為cn111334443a的中國發明專利公開了一種耐受香草酸、對羥基苯甲酸和丁香酸的釀酒酵母菌株及其應用，其通過適應性進化強化釀酒酵母的酚酸抑制物耐受性，但僅能解決菌株酚酸耐受差的問題，難以有效解決毒性更強酚醛類抑制物的耐受性問題，從而導致纖維素乙醇生產速率低，發酵周期長。

技術實現思路

1、本發明的目的是解決上述技術問題，提供一種耐受酚醛抑制物的釀酒酵母，該釀酒酵母可以具有更高的酚醛耐受性，本發明的第二個目的是提供一種該釀酒酵母在提高纖維素乙醇生產速率，縮短發酵周期中的應用；本發明的再一目的是提供高耐受酚醛抑制物的關鍵基因。

2、為實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

3、一株耐受酚醛抑制物的釀酒酵母，該菌株分類命名為釀酒酵母（ saccharomyces? cerevisiae）s91，已于2024年4月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.30280；保藏地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。

4、本釀酒酵母s91由常熟理工學院生物與食品工程學院實驗室培養獲得，直接來源是酒曲，發現日期為：2023年7月6日；發現者為顏釗；本釀酒酵母s91相比普通的出發菌株釀酒酵母具有更高的酚醛抑制物耐受能力，對于單一酚醛和多種酚醛均具有較高的耐受上限，其細胞生長、葡萄糖消耗速率和乙醇生產均顯著提高，發酵延滯期明顯縮短。

5、進一步地，本發明釀酒酵母s91中發現表達有一種耐受酚醛抑制物的基因pst2，所述基因其核苷酸序列如seq?id?no.1所示，該基因的表達可以顯著提高菌株的酚醛耐受能力。

6、進一步地，本發明提供了一種上述耐受酚醛抑制物的基因pst2的表達載體pyx212-pst2，所述表達載體pyx212-pst2核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

7、優選地，在所述表達載體中插入了強啟動子tef1和強終止子cyc1，用于強化關鍵基因的表達。

8、進一步地，本發明提供了一種重組工程菌，該重組工程菌可表達上述耐受酚醛抑制物的基因。

9、進一步地，本發明提供了上述高耐受酚醛抑制物的釀酒酵母或上述重組工程菌在發酵含酚醛抑制物的發酵底物生產醇類物質中的應用。

10、進一步地，本發明提供了上述耐受酚醛抑制物的基因或上述表達載體在強化菌株的酚醛抑制物耐受性能或耐受酚醛抑制物的菌株育種中的應用。

11、更進一步地，所述酚醛抑制物包括4-羥基苯甲醛、丁香醛及香草醛中的至少一種。

12、優選地，當發酵底物中僅含有單一的酚醛抑制物，本菌株對4-羥基苯甲醛的耐受上限可以達到12?mm，對丁香醛的耐受上限可以達到14?mm，對香草醛的耐受上限可以達到12?mm。

13、優選地，當發酵底物中含有相同濃度的三種酚醛抑制物4-羥基苯甲醛、丁香醛及香草醛時，其耐受上限濃度可以達到10?mm。

14、更進一步地，所述發酵含酚醛抑制物的發酵底物生產醇類物質，其中發酵底物為未經酶解的木質纖維素或經酶解后的木質纖維素；所述醇類物質為乙醇。

15、進一步地，上述應用包括如下步驟：對預處理后的木質纖維素物料進行纖維素酶酶解，纖維素酶用量為15~20?fpu/g木質纖維素物料，糖化36~48?h，溫度45~50℃，過濾滅菌后制備得到水解液，最后接種上述的釀酒酵母s91或上述的重組工程菌作為菌種至所述水解液中，所述種子液菌種的濃度為1.2×108~2.5×108cfu/ml；其中cfu（colony-formingunits）表示單位體積的菌落總數；接種量為5%~10%（v/v），在30~35℃條件下發酵48~72?h。

16、進一步地，上述應用包括如下步驟：將預處理后的木質纖維素物料、纖維素酶和擴培后的菌種混合，纖維素酶用量為15~20?fpu/g物料，菌種接種量為5%~10%（v/v），在30~35℃條件下進行發酵，發酵72~96?h；所述菌種為上述的釀酒酵母s91或上述的重組工程菌，所述種子液菌種的濃度為1.2×108~2.5×108cfu/ml。

17、優選地，所述菌種在接種前還需要進行活化和擴陪，得到一級種子液和二級種子液，所述一級種子液和二級種子液制備方法如下：

18、s1.菌種的活化：將在25%~30%（v/v）甘油保存的釀酒酵母在yepd固體培養基（以質量計，1%~2%葡萄糖，0.5%~1%酵母提取物，0.5%~1%蛋白胨，0.1%~0.2%磷酸二氫鉀，1.5%~2%瓊脂粉）中活化24~48?h直至長出單菌落，培養溫度為30~35℃；

19、s2.一級種子液：挑取釀酒酵母的單菌落接種至yepd液體培養基（以質量計，1%~2%葡萄糖，0.5%~1%酵母提取物，0.5%~1%蛋白胨，0.1%~0.2%磷酸二氫鉀）中，在30~35℃、轉速150~200?rpm培養12~16?h；

20、s3.二級種子液：吸取一級種子液接種至發酵培養基（以質量計，2%~4%葡萄糖，0.5%~1%酵母提取物，0.5%~1%蛋白胨，0.1%~0.2%磷酸二氫鉀）中，接種量為5%~10%（v/v），在30~35℃、轉速150~200?rpm培養12~16?h。

21、優選地，上述的預處理方法包括稀酸法或者堿處理法中的一種。

22、更優選地，所述預處理方法為稀酸法時，預處理條件為：硫酸溶液濃度為1~5%wt，預處理溫度在100~180℃，時長控制在3~60?min，料液比（以質量計）為1:1~1:10。

23、更優選地，所述預處理方法為堿處理法時，預處理條件為：naoh溶液濃度為1~4%wt，預處理溫度在80~120℃，時長控制在6~24?h，料液比（以質量計）為1:1~1:10。

24、優選地，所述木質纖維素物料選用玉米秸稈、水稻秸稈、小麥秸稈、玉米芯殘渣、竹子和木屑中的至少一種。

25、本發明的有益效果如下：

26、（1）本發明的釀酒酵母菌株s91比出發菌株具有更高的單一酚醛抑制物耐受能力，對于丁香醛和4-羥基苯甲醛耐受上限從10?mm提高至12?mm濃度，而對于丁香醛耐受上限從12?mm提高至14?mm濃度。

27、（2）本發明的釀酒酵母菌株s91比出發菌株具有更高的混合酚醛抑制物耐受能力；在8?mm濃度下，釀酒酵母s91的細胞生長和乙醇生產相比于出發菌株分別提高了9.1和10.9倍；在10?mm濃度下，釀酒酵母s91的細胞生長和乙醇生產相比于出發菌株分別提高了1.2和4.3倍。

28、（3）本發明的釀酒酵母菌株s91在進行纖維素乙醇發酵時具有優異的發酵性能；相比于出發菌株，釀酒酵母s91在48?h內的葡萄糖消耗速率、乙醇生產速率和細胞活力分別提高了65.4%、63.3%和1.9倍，發酵延滯期縮短了12?h以上。

29、（4）本發明中過表達pst2的重組菌株，相比于攜帶空載質粒的對照菌株，釀酒酵母pyx212-pst2在8?mm混合酚醛抑制物條件下細胞生長和乙醇生產分別提高了4.2和4.5倍，在10?mm混合酚醛抑制物條件下細胞生長和乙醇生產分別提高了1.6和2.5倍。

30、生物材料保藏：

31、本釀酒酵母（ saccharomyces?cerevisiae）s91，于2024年4月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號為cgmcc?no.30280。