本技術涉及醫藥，具體涉及一種單磷酸類脂a及其合成方法和應用。

背景技術：

1、自九十年代以來，傳染病爆發對人類的生命財產安全產生了極大的威脅，接種疫苗是有效預防傳染病的重要措施。但疫苗中部分抗原存在免疫原性弱的問題，單獨注射疫苗往往無法達到預期的效果。免疫佐劑是指可以通過增加抗原表面積、緩釋抗原、促進炎癥反應等方式刺激機體，從而改變、增強機體對抗原的特異性免疫應答的物質。鋁鹽可引起注射部位產生炎癥并可能導致局部紅斑、肉芽腫和皮下結節的產生，同時，鋁鹽佐劑可能延緩部分中和抗體的釋放，因此在應用時受到多種限制。綜上所述，開發新型疫苗佐劑是非常必要且有意義的。

2、來源于革蘭氏陰性菌細胞膜的脂多糖，其活性單元類脂a可以被toll樣受體4(toll?like?receptor?4，tlr-4)識別，繼而刺激免疫系統的活化，使機體產生多種炎癥因子。但野生型來源類脂a會造成人體免疫系統反應過度，誘導過強的炎癥反應和敗血性休克，甚至導致膿毒癥的產生。因此不適合作為佐劑使用。單磷酸類脂a(mpl)是一種具有單磷酸結構的類脂a混合物，與野生型來源類脂a相比，其不良反應率較低，但目前市售類脂a仍存在毒性反應較強、且制備成本高昂等難題，因此難以普及使用。現有mpl的生產方法有：一是從沙門氏菌中提取獲得，但沙門氏菌為較強致病菌，危險性較大；二是化學工藝合成，但步驟較多，路線較長，造價昂貴。諸多問題限制著大規模的生產及使用。

技術實現思路

1、本發明目的在于解決現有的技術問題，進而提出一種單磷酸類脂a及其合成方法和應用。

2、為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

3、一種單磷酸類脂a，單磷酸類脂a為式一所示；其化學式為c94h177n2o23p，分子質量為1734.25，其結構類脂a的基礎上(以β-(1’-6)連接的d-葡萄糖胺二糖為骨架，c1、c4’位磷酸化，c2、c3位氨基分別連接十四烷氧基，c3’位連接(r)-3-(十四烷氧基)十四烷基，c2’位氨基連接(r)-3-(十二烷氧基)十四烷基，)缺失c1位磷酸基團，c3’位次級脂肪酸鏈中2號位c中引入一個羥基基團替換原有氫原子；

4、

5、一種所述的單磷酸類脂a的合成方法，構建產單磷酸類脂a工程菌，利用工程菌代謝提取獲得式一所示單磷酸類脂a。

6、所述產單磷酸類脂a工程菌為以大腸桿菌為宿主，對其基因組中laci發生缺失突變，于lacz基因位點處敲入表達基因lpxe、lpxo基因，即獲得產單磷酸類脂a的工程菌e.coli?w3110△laci?lacz::fn?lpxe?lpxo。

7、一種所述的單磷酸類脂a的應用，所述單磷酸類脂a在作為疫苗佐劑中的應用。

8、一種產單磷酸類脂a工程菌，工程菌為以大腸桿菌為宿主，對其基因組中laci發生缺失突變，于lacz基因位點處敲入表達基因lpxe、lpxo基因，即獲得產單磷酸類脂a的工程菌e.coli?w3110△laci?lacz::fn?lpxe?lpxo。

9、所述于宿主菌株中調控基因laci基因發生缺失，插入來自于根癌農桿菌c58的lpxe基因，來自于鼠傷寒沙門氏菌14028s的lpxo基因。

10、工程菌構建的方法和步驟

11、1)將人工構建laci敲除基因片段轉化入e.coli?w3110感受態中，獲得突變株e.coli?w3110△laci::fkan，通過位點特異性重組去除卡那霉素抗性基因。

12、2)構建fn-lpxe-lpxo敲入基因片段合成步驟:①于根癌農桿菌c58基因組中，獲得lpxe基因。②于鼠傷寒沙門氏菌14028s基因組中，獲得lpxo基因。③通過限制性核酸內切酶酶切，d4連接酶酶連，獲得fn-lpxe-lpxo敲入基因片段。

13、3)將步驟2)中人工構建敲入基因片段轉入步驟1)制備的e.coli?w3110△laci感受態細胞中，獲得突變菌株e.coli?w3110△laci?lacz::fnlpxe?lpxo::fkan，通過位點特異性重組去除卡那霉素抗性基因。

14、所述laci敲除基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

15、所述lpxe敲入基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

16、所述lpxo敲入基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

17、步驟1)所述的位點特異性重組為cre酶介導的loxp位點特異性重組。

18、步驟2)所述的位點特異性重組為flp酶介導的frt位點特異性重組。

19、一種所述的產單磷酸類脂a工程菌的應用，所述工程菌在產單磷酸類脂a中的應用。

20、進一步的說，將所述工程菌擴繁，離心，破碎，醋酸鈉酸水解，萃取，純化等。

21、所述純化為通過deae-52纖維素陰離子交換柱純化，流動相為三氯甲烷/甲醇/醋酸銨溶液，通過改變醋酸銨的濃度(0-480mm)達到洗脫純化目的，洗脫流速為0.03～12ml/min。

22、更進一步的說，將復蘇后工程菌液按照1∶1000(v/v)比例接種于0.2l新鮮的lb培養基中，37℃培養至od600＝1時，4℃，8000rpm離心20min，收集菌體，ddh2o洗滌菌體一次后，用bligh-dyer一相體系(三氯甲烷/甲醇/水，1∶2∶0.8，體積比)懸浮菌體，磁力攪拌1h，3000rpm離心20min，使用一相體系洗滌沉淀2-3次；加入27ml含有1％十二烷基磺酸鈉(sds)12.5mm醋酸鈉(ph4.5)溶液，超聲震蕩20min，100℃水浴30min裂解多糖臂。冷卻至室溫，加入30ml三氯甲烷和30ml甲醇配成bligh-dyer二相體系(三氯甲烷/甲醇/水，2∶2∶1.8，體積比)，分層，多次萃取，保留三氯甲烷層旋轉蒸發，最后加入三氯甲烷/甲醇溶液(4∶1，體積比)將kma洗出。

23、對上述獲樣品純化制備使用deae-52纖維素陰離子交換色譜法：將kma粗樣溶于三氯甲烷/甲醇/水(2∶3∶1，體積比)溶液，上樣于事先用6倍體積三氯甲烷/甲醇/水(2∶3∶1，體積比)溶液平衡的deae-52纖維素陰離子交換柱，用三氯甲烷/甲醇/120mm醋酸銨(2∶3∶1，體積比)溶液洗脫磷脂等雜質，再用三氯甲烷/甲醇/480mm醋酸銨(2∶3∶1，體積比)溶液將kma進行洗脫并收集，收集洗脫液配成三氯甲烷/甲醇/水二相體系(2∶2∶1.8，體積比)；離心取下相，旋蒸除去溶劑，得類脂a純品，-20℃保存。

24、kma的檢測、分析

25、1)薄層層析(tlc)檢測：

26、將樣品點樣于gel?60tlc薄層板上，展開劑為三氯甲烷/甲醇/水/氨水(40∶25∶4∶2，體積比)。層析結束后吹干殘留展開劑，用10％硫酸乙醇碳化，置于加熱板上顯色。

27、2)衍生化-hplc檢測:

28、類脂a并不具備紫外顯色基團，但是脫磷酸基團后剩余羥基基團可以與3，5-二硝基芐氧基胺鹽酸鹽(dnba)-吡啶在60℃下共軛作用，得到具有紫外活性的o-二硝基芐基肟。

29、hplc分析采用賽默飛液相色譜系統，柱溫50℃，紫外檢測器(254nm)。使用thermoscientific?vanquish?chromeleon?7軟件進行系統控制和數據收集/處理。本研究采用agilent?zorbax?c18，粒徑5μm,250mm×4.6mm不銹鋼色譜柱。

30、流動相為(a)乙腈-5mm正四丁基磷酸銨(tbap)水溶液(95∶5,體積比)和(b)異丙醇-5mm正四丁基磷酸銨(tbap)水溶液(95∶5,體積比)。進樣量為10μl，流速1.0ml/min，以流動相b10％～80％的線性梯度洗脫60min，進行紫外檢測。

31、esi/ms分析：kma樣品溶于三氯甲烷/甲醇(4∶1，體積比)溶液中，在waters?synaptq-tof?mass?spectrometer質譜儀上進行質譜檢測。采用esi離子源，陰離子檢測模式，m/z檢測范圍小于1800。

32、一種所述的產單磷酸類脂a工程菌的應用，所述工程菌培養代謝獲得的單磷酸類脂a在作為疫苗佐劑中的應用。

33、一種疫苗佐劑，佐劑含所述的單磷酸類脂a或所述的工程菌株。

34、具體為

35、1)將單磷酸類脂a(kma)加入到65℃預熱過的12％卵磷脂/角鯊烯(w/v)溶液中，于65℃水浴中靜置60min，直至完全溶解。

36、2)將上述獲得溶解液與0.5％?tween?80/水溶液同時65℃預熱，按照1∶10(v/v)的比例混合，使用均質機徹底乳化均勻，即獲得佐劑待用。

37、所述疫苗為流感疫苗

38、本發明所具有的優點：

39、本發明構建獲得生產單磷酸類脂a的基因工程菌，其生產步驟中不涉及致病菌，可用于kma大規模生產，其代謝產物獲得kma為具有結構新穎、具有免疫佐劑活性，通過體內實驗已經證明了所述kma能夠增強疫苗的免疫應答反應，對流感疫苗具有較好的免疫佐劑活性，且具有很好的安全性。

40、本發明所得kma為具有特殊結構、減毒、六條脂肪酸鏈kma，該化合物具有雙親性，能夠直接提取并被esi質譜檢測鑒定，在保留其六條脂肪酸鏈以有最大免疫活性的基礎上，引入羥基基團，提高其水溶性；單磷酸結構使其毒性降低，能夠激活宿主的先天性免疫系統，可作為免疫佐劑與疫苗共同施用。