本發明涉及干細胞治療，尤其涉及一種過表達med1的間充質干細胞及其制備方法與應用。

背景技術：

1、超級增強子(super?enhancers，ses)是由高密度的傳統增強子(tes)簇組成，它們協同作用以招募高密度的轉錄因子(tfs)和輔因子，從而實現高效的轉錄，主要特點是具有比普通增強子更大的區域跨度以及更高密度的轉錄激活相關組蛋白(如h3k27ac和h3k4me1)修飾。

2、間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，mscs)作為具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化的潛能、維持組織穩態和再生、以及強大的免疫調節能力的多能干細胞，是體內成骨細胞的主要來源，在骨骼修復和再生中具有關鍵的作用。由嚴重創傷、感染、腫瘤手術或股骨頭壞死導致的骨缺損往往難以自然愈合。mscs移植促進骨缺損部位再生目前被視為潛在的治療方法。有許多實驗和臨床研究，骨外基質細胞促進骨再生。然而，大多僅顯示出有限的治療效果。為了增強mscs的成骨潛能，促進臨床應用，基于基因修飾mscs的工程策略展現了良好的應用前景。然而，傳統上利用慢病毒或者腺相關病毒對mscs進行基因修飾存在潛在的生物安全隱患，其他物理或者化學方法也存在修飾效率較低等因素的限制，故臨床上用mscs移植治療骨缺損的應用受到了阻礙。目前由于骨移植手術的各種局限性，因此對于難以愈合的骨缺損疾病，迫切需要開發有效的治療方法。

技術實現思路

1、本發明的目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種具有能夠促進骨修復和骨再生的過表達med1的間充質干細胞及其制備方法與應用。

2、為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

3、第一方面，本發明提供了一種過表達med1的間充質干細胞，包括如seq?id?no:2所示的核苷酸序列和dcas9-target質粒。

4、本發明發現介體復合物亞基1(med1)作為超級增強子(ses)調控機制中關鍵的轉錄共激活因子，能夠與ses結合，可提高充質干細胞(mscs)的成骨分化能力，從而增強mscs移植的治療效果。本發明使用改良的crispra/dc?as9技術，通過人工突變cas9的兩個結構域ruvc和hnh，使其失去核酸內切酶的活性，再通過設計med1特異的grna，將融合了轉錄因子vp64、p65激活結構域和rta的dcas9特異地導向med1的轉錄起始位點(tss)位點，通過轉錄因子的激活作用促進mscs中med1的轉錄，成功構建了穩定過表達med?1的mscs。通過體外和體內實驗驗證了移植med1過表達mscs能夠治療骨缺損以及促進骨再生。

5、作為第一方面的優選實施方式，所述dcas9-target質粒為dsp-vp64-p65-rt?a質粒。

6、作為第一方面的優選實施方式，所述間充質干細胞還包括如seq?id?no:1所示的核苷酸序列。

7、作為第一方面的優選實施方式，所述間充質干細胞所述間充質干細胞選自骨髓、脂肪、臍帶、誘導多能干細胞、胚胎干細胞來源的間充質干細胞中的一種或幾種。

8、作為第一方面的優選實施方式，所述間充質干細胞包括骨髓來源的間充質干細胞。

9、由于人類骨髓來源的mscs(bmscs)在促進成骨方面更為有效，而臍帶來源的mscs則更能促進血管生成。誘導多能干細胞(ips)來源的mscs和人類胚胎干細胞的mscs具有類似的成骨能力。進一步的研究發現，在體外和體內的軟骨內骨化潛力對比中，只有bmscs能夠在體外形成三維軟骨盤，并成功治愈了小鼠的巨大骨缺損。因此，bmscs被認為是最具成骨再生潛力的細胞類型。

10、第二方面，本發明提供了第一方面所述的間充質干細胞在制備治療或修復骨缺損藥物或制劑中的應用。

11、作為第二方面的優選實施方式，根據med1的tss上游序列設計特異的sgrna，通過sgrna將融合了轉錄因子vp64、p65激活結構域和rta的dcas9特異地導向med1的tss位點，通過轉錄因子的激活作用促進med1在間充質干細胞中轉錄，構建得到過表達med1的間充質干細胞；所述med1的tss上游序列的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

12、作為第二方面的優選實施方式，所述根據med1的tss上游序列設計特異的sgrna的序列如seq?id?no:2所示；

13、作為第二方面的優選實施方式，所述融合了轉錄因子vp64、p65激活結構域和rta的dcas9為質粒dsp-vp64-p65-rta。

14、第三方面，本發明提供了一種構建第一方面所述的間充質干細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

15、s1、根據如seq?id?no:1所示的med1的tss上游序列設計特異的sgrn?a，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no:2所示；

16、s2、將dcas9-target質粒，sgrna與opti-mem培養基混合得到預混液1；

17、s3、將輔助轉染試劑與opti-mem培養基混合得到預混液2；

18、s4、將預混液1和預混液2混合后加入細胞培養基中，經室溫孵育后將培養基加入培養間充質干細胞的孔板里，隨后向培養基中添加嘌呤霉素篩選能存活的間充質干細胞，構建得到過表達med1的mscs。

19、作為第三方面的優選實施方式，所述步驟s2中dcas9-target質粒為dsp-vp?64-p65-rta質粒。

20、第四方面，本發明提供了第三方面所述的構建方法在制備治療或修復骨缺損藥物或制劑中的應用。

21、與現有技術相比，本發明的有益效果是：

22、本發明人發現介體復合物亞基1(med1)作為轉錄共激活因子對于ses在調控mscs成骨分化中起重要作用；故本發明基于超級增強子機制通過調控me?d1的表達從而提高mscs的成骨功能，可以更加精確并且有效地增強mscs的成骨功能，從而推動mscs移植在骨缺損移植中的應用效果。本發明首創通過構建med1基因修飾mscs，提高其成骨分化功能，從而促進其在骨缺損中的臨床治療效果。

技術特征：

1.一種過表達med1的間充質干細胞，其特征在于，包括如seq?id?no:2所示的核苷酸序列和dcas9-target質粒。

2.如權利要求1所述的間充質干細胞，其特征在于，還包括如seq?id?no:1所示的核苷酸序列。

3.如權利要求1或2所述的間充質干細胞，其特征在于，所述間充質干細胞選自骨髓、脂肪、臍帶、誘導多能干細胞、胚胎干細胞來源的間充質干細胞中的一種或幾種。

4.如權利要求1-3任一項所述的間充質干細胞在制備治療或修復骨缺損或骨再生藥物或制劑中的應用。

5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，根據med1的tss上游序列設計特異的sgrna，通過sgrna將融合了轉錄因子vp64、p65激活結構域和rta的dcas9特異地導向med1的tss位點，通過轉錄因子的激活作用促進me?d1在間充質干細胞中轉錄，構建得到過表達med1的間充質干細胞；所述me?d1的tss上游序列的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述根據med1的tss上游序列設計特異的sgrna的序列如seq?id?no:2所示。

7.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述融合了轉錄因子vp64、p65激活結構域和rta的dcas9為質粒dsp-vp64-p65-rta。

8.一種構建如權利要求1-3任一項所述的間充質干細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟s2中dcas9-target質粒為dsp-vp64-p65-rta質粒。

10.如權利要求7-9任一項所述的構建方法在制備治療或修復骨缺損或骨再生藥物或制劑中的應用。

技術總結
本發明涉及一種過表達MED1的間充質干細胞及其制備方法與應用，屬于干細胞治療技術領域。本發明過表達MED1的間充質干細胞包括如SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列和dCas9?target質粒。本發明首創構建MED1基因修飾的MSCs，提高了其成骨分化功能，從而促進其在骨缺損中的臨床治療效果。

技術研發人員：沈慧勇,吳燕峰,謝中瑜,李奇波,余文輝,張偉豪,龐培卓,陳俊華
受保護的技術使用者：中山大學附屬第八醫院（深圳福田）
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28