本發明屬于有機小分子熒光探針領域，具體涉及一種作為一氧化氮熒光探針使用的(e)-2-(3-(4-氨基-3-羥基苯乙烯基)-5,5-二甲基環己-2-烯-1-亞基)丙二腈的制備方法與使用方法。

背景技術：

1、一氧化氮(no)是生物系統中普遍存在的信使分子，在3種no合成酶(enos，nnos和inos)作用下由nadph，o2和l-精氨酸內源性的生成。它具有多樣的生理功能，包括信號轉導、血管舒張和平滑肌松弛等作用，同時積極參與免疫介導的病理過程，在心血管系統、生殖系統、中樞及外圍神經系統中發揮重要生理功能。no的失調將導致多種疾病，包括癌癥、炎癥、內皮功能障礙和神經變性等。因此，開發人體內no水平的特異性檢測方法，對理解和研究其相關的生理病理過程至關重要。

2、熒光檢測法由于其可操作性強、成本低、生物體相容性好并能實現活體內的實時在線檢測等優點，受到研究者們的廣泛關注。

3、在過去的十幾年中,研究人員基于過渡金屬復合物型和鄰苯二胺識別基團已經開發了多種no熒光探針。然而，生物兼容性差導致過渡金屬復合物型探針很少應用于生物體中no的研究；基于鄰苯二胺-羅丹明內酰胺型的no熒光探針與no反應生成的n-?；虍a物，該產物存在緩慢水解作用且容易受cys等生物硫醇的進攻而導致熒光猝滅。近年來,研究人員又陸續開發了許多新型no探針，如胺基亞硝化型,脫氨型,se醚型和漢斯酯型等類型,這些探針的開發在一定程度上解決了生物兼容性和對no的反應性、選擇性等問題。

4、然而，基于反應型的一氧化氮熒光探針(參見綜述chenqian?ye,shufang?lin,jinyi?li,peng?meng,luqiang?huang,daliang?li,comprehensive?insights?intofluorescent?probes?for?the?determination?nitric?oxide?for?diseases?diagnosis,bioorganic?chemistry,2024,150,107505)，其中包括鄰苯二胺類、漢斯酯類、胺基亞硝化等no響應模式，盡管能夠特異性地檢測no的濃度水平，然而，大多數的探針依舊存在熒光探針穩定性差、合成過程冗雜困難、以及由于檢測模式單一而導致的靈敏度不足等問題，限制了它們在生物體內的進一步應用。

技術實現思路

1、為了克服現有技術的上述缺陷，本發明提出了一種可以檢測一氧化氮的比率型熒光探針(bnoh)。利用本發明可定量檢測樣品中一氧化氮的含量。

2、與傳統的熒光染料相比，二氰基異佛爾酮類熒光染料具有紅色發射和較大斯托克斯位移的特點，并且易于合成，近年來被廣泛應用于熒光探針領域。因此，基于異佛爾酮熒光母團，我們構建了經典的分子內電荷轉移(ict)熒光探針。因其具有的ict效應使得探針本身呈現紅色熒光，但當存在一氧化氮的條件下，一氧化氮與探針分子上的胺基發生還原脫氨反應，進而抑制了分子的ict效應，使得探針分子發射出黃色熒光，通過上述方案，獲得了“比率”型的熒光響應，實現了對一氧化氮的高靈敏、特異性檢測。

3、本發明所述一氧化氮熒光探針命名為(e)-2-(3-(4-氨基-3-羥基苯乙烯基)-5,5-二甲基環己-2-烯-1-亞基)丙二腈，結構式如式(i)所示：

4、

5、上述熒光探針的制備方法如下：將一定量的(1)，二水合氯化亞錫(2)和鹽酸(3)溶于無水乙醇中，在一定溫度下反應一段時間。反應完全后，旋干經柱層析得到黑紅色固體化合物(e)-2-(3-(4-氨基-3-羥基苯乙烯基)-5,5-二甲基環己-2-烯-1-亞基)丙二腈(4)即：bnoh。

6、上述探針的制備反應式如下：

7、

8、上述一氧化氮熒光探針的使用方法如下：

9、步驟1：向不同濃度一氧化氮溶液中加入相同濃度的式(i)所示化合物，配置至少5種不同一氧化氮含量的含有式(i)所示化合物的標準溶液；

10、所示標準溶液中式(i)所示化合物的濃度為10μm；

11、所示標準溶液中一氧化氮的含量為10nm～100μm；

12、步驟2：分別測定所述標準溶液的熒光發射光譜，激發波長為415nm，以一氧化氮濃度為橫坐標，以i522和i656為縱坐標，建立標準曲線；

13、i522表示所述標準溶液在波長為522nm處的熒光發射峰強度值；i656表示所述標準溶液在波長為656nm處的熒光發射峰強度值；

14、步驟3：向待測樣品中加入式(i)所示化合物，控制其濃度與所述標準溶液中式(i)所示化合物的濃度相等；測定其在激發波長為415nm的激發光下的熒光發射譜，即根據標準曲線計算得出待測樣品的一氧化氮含量。

15、本發明具有如下特點：

16、1)本發明提供的熒光探針是黑紅色固體粉末，具有良好的光學穩定性。

17、2)本發明提供的熒光探針，其溶液對一氧化氮的濃度敏感，隨著一氧化氮的增加，熒光燈下觀察到其水溶液的熒光由紅色變為黃色。

18、3)本發明提供的熒光探針，其發射波長位于656nm，加入一氧化氮后，522nm處出現新的發射峰，為“比率”型響應，能大大消除檢測時檢測環境差異對結果的影響，提高檢測的靈敏度。

19、4)本發明提供的熒光探針對一氧化氮濃度呈線性關系，可用于一氧化氮精確測量。

20、本發明提供的基于異佛爾酮染料的“比率”型一氧化氮探針對一氧化氮溶液具有良好的響應，能夠實現對樣品內一氧化氮的靈敏定量檢測，具有操作簡便，成本低廉，響應靈敏，易于推廣和應用等優點。

技術特征：

1.一種檢測一氧化氮的熒光探針,其特征在于：其分子式為c19h19n3o，簡稱bnoh，結構式為式(i)；

2.根據權利要求1所述的一種檢測一氧化氮的熒光探針的制備方法，其特征在于，合成步驟如下：

3.一種檢測一氧化氮的熒光探針的使用方法；其特征在于：

4.根據權利要求1所述的一種檢測一氧化氮的熒光探針的制備方法，其特征在于：

5.根據權利要求1所述的一種檢測一氧化氮的熒光探針的制備方法，其特征在于：

技術總結
本發明公開了一種檢測一氧化氮的熒光探針及其制備方法與使用方法。該探針以異佛爾酮為熒光母團，以取代苯胺作為NO的識別基團，能高選擇、高靈敏的檢測水相中NO的濃度水平。探針本身呈現紅色熒光，當存在一氧化氮的條件下，一氧化氮與探針分子上的胺基發生亞硝化?脫氨反應，生成了相應的脫氮產物，抑制了探針分子的ICT效應，使得探針發射波長藍移，發出黃色熒光。通過上述方案，探針對NO獲得了“比率”型的熒光響應，實現了對一氧化氮的高靈敏、特異性檢測。

技術研發人員：韓益豐,林濱
受保護的技術使用者：浙江理工大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24