本發明屬于生物，涉及一種組織工程皮膚類器官的構建方法以及一種uvb誘導的皮膚類器官衰老模型。

背景技術：

1、將胚胎干細胞(embryonic?stem?cells，escs)、誘導多能干細胞(inducedpluripotent?stem?cells，ipscs)或來源于組織的干、祖細胞通過三維培養技術進行體外培養獲得的具有器官特異性的產物，被稱為類器官。

2、皮膚類器官是一種新興的類器官模型，可由誘導多能干細胞(ipscs)或全能干細胞誘導分化得到，一般具有透明球囊狀頭部和不透明尾部，能夠部分模擬真實皮膚組織的結構和功能，模擬體內的通訊，能在一定程度上代替動物模型，現已廣泛應用于皮膚發育、疾病模型、藥物篩選等研究領域。相比于傳統2d細胞模型，類器官模型在體外培養過程中有著更為穩定的基因和表型特征，以及更為豐富的細胞類型。

3、現有的體外皮膚研究模型多以體外培養的2d皮膚細胞、3d自組裝皮膚細胞模型為主，層間相互作用與真實生理狀態還存在較大差距，缺少皮膚附屬物等結構，與真實的皮膚存在較大差距。利用人ipscs，目前可構建與18周的人類胎兒皮膚相似的，由分層表皮、富含脂肪的真皮和帶有皮脂腺的色素毛囊，以及感覺神經元、施萬細胞和觸覺相關merkel細胞組成的囊樣皮膚器官，該皮膚類器官可在裸鼠背部形成含毛發的皮膚類器官。但現有皮膚類器官的局限性主要是其成球形生長帶來的解剖層次紊亂。正常的皮膚結構最外層是角質形成細胞形成的角質層，其作為皮膚的物理屏障，當細胞衰老和死亡時脫落。而皮膚類器官形成球狀囊泡，其中毛干向內朝向充滿液體的核心生長，并伴有毛囊從囊泡表面向外突出。在皮膚類器官培養過程中，囊性結構限制脫落，并在核心中積聚角質化組織。因此，在后期階段在培養物(>150天)中，可觀察到浮動的死角質細胞長出到類器官的表面。這種內向生長的特性使皮膚類器官的組織結構與生理性皮膚結構在解剖學與組織學上相差甚遠。

4、目前尚未有uvb誘導的皮膚類器官衰老模型。

技術實現思路

1、本發明的第一個目的在于提供一種組織工程皮膚類器官及其構建方法，以解決上述技術問題中的至少一個。

2、本發明的第二個目的在于提供一種uvb誘導的皮膚類器官衰老模型，以解決上述技術問題中的至少一個。

3、根據本發明的一個方面，提供了一種組織工程皮膚類器官的構建方法，包括如下步驟：

4、(1)取ipscs進行誘導分化并進一步培養至第85～100天，構建得到初級皮膚類器官；

5、(2)將脫細胞豬皮進行切片，切片厚度為90～110μm，得脫細胞豬皮切片；

6、(3)將初級皮膚類器官解剖后，取其透明球囊狀結構按內面朝上，外面朝下的方式接種于脫細胞豬皮切片上，得到復合物；

7、(4)將復合物進行氣液界面培養10～21天，即得組織工程皮膚類器官。

8、本發明采用“解剖接種”的方式，對由ipscs誘導分化得到的具有真皮結構朝外、表皮結構朝里的透明球囊狀頭部結構的初級皮膚類器官進行解剖，去掉其由致密不透明細胞團組成的尾部，將其透明球囊狀結構剖開后按表皮層朝上、真皮層朝下的接種方式接種在脫細胞豬皮支架上，并采用氣液界面培養系統培養，構建得到一種組織工程皮膚類器官。

9、本發明提供的組織工程皮膚類器官包含表皮層、基底層、真皮層(成纖維細胞)、毛囊、色素細胞、皮脂腺、感覺神經元、默克爾細胞等皮膚附屬物，呈現出自上而下的解剖結構，其結構接近人皮膚的生理解剖結構，并且表皮層更接近人體生理狀態。

10、本發明提供的組織工程皮膚類器官可應用于疾病模型構建。本發明提供的組織工程皮膚類器官能高度模擬皮膚組織的生理結構和功能，如表皮、真皮及附屬結構(如毛囊、汗腺等)，可為研究皮膚疾病的病理機制提供更接近真實環境的模型；一方面，通過進一步的誘導分化處理，可以在組織工程皮膚類器官的基礎上構建出具有特定皮膚疾病特征的類器官，如皮膚癌、銀屑病等，這些模型有助于深入了解疾病的發生發展過程；另一方面，在組織工程皮膚類器官上進行研究，可以探索不同細胞類型和分子信號通路在疾病發生中的相互作用，為疾病的診斷和治療提供新的靶點和思路。

11、本發明提供的組織工程皮膚類器官可應用于藥物篩選和毒性測試。本發明提供的組織工程皮膚類器官可用于高通量藥物篩選，通過檢測藥物對組織工程皮膚類器官的作用效果，可以快速篩選出具有潛在治療價值的候選藥物。利用組織工程皮膚類器官進行毒性測試，可以評估藥物對皮膚的潛在毒性，包括刺激性、過敏性等，為藥物的安全性評價提供重要數據。此外，結合患者的遺傳信息和疾病特征，可以構建出個性化的組織工程皮膚類器官模型，用于評估患者對特定藥物的反應，指導個性化治療方案的制定。

12、本發明提供的組織工程皮膚類器官可應用于皮膚損傷與修復再生，利用組織工程皮膚類器官作為修復材料，通過細胞培養、擴增和分化，可以制備出具有生物活性和特定功能的皮膚替代物，用于皮膚缺損的修復；此外，組織工程皮膚類器官中包含的多種細胞類型和生長因子可以促進皮膚組織的再生和修復，加速傷口愈合過程。由此，本發明提供的組織工程皮膚類器官可應用于燒傷、慢性皮膚潰瘍等皮膚疾病的治療。

13、在一些實施方式中，利用ipscs進行誘導分化構建初級皮膚類器官的方法可以參考文獻“lee?j,van?der?valk?wh,serdy?sa,deakin?c,kim?j,le?ap,koehlerkr.generation?and?characterization?of?hair-bearing?skin?organoids?from?humanpluripotent?stem?cells.nat?protoc.2022may；17(5):1266-1305.”記載的方法。

14、在一些實施方式中，利用ipscs進行誘導分化構建初級皮膚類器官的方法可以包括如下步驟：

15、s1、將ipscs細胞懸浮在含有20μm?y27632的e8培養基中，然后將其接種到細胞培養裝置上，110g離心6min后，將細胞置于37℃，5％?co2培養箱中孵育24h；然后補充e8培養基繼續培養24h，得細胞聚集體；

16、s2、誘導分化第0天，收集細胞聚集體，用含2％?matrigel，10μmsb431542，4ng/mlbfgf和2.5ng/ml?bmp4的e6培養基進行誘導分化；

17、s3、誘導分化第3天，加含200ng/ml?ldn-193189(bmp?inhibitor)和250ng/mlbfgf的e6培養基；

18、s4、誘導分化第6天，加e6培養基，并在第8天和第10天用e6培養基進行一次半量換液；

19、s5、誘導分化第12天，收集細胞聚集體，加入含有1％?matrigel的皮膚類器官成熟培養基，并置于搖床上，在5％?co2、37℃、65rpm的條件下培養，并在第15天用含有1％matrigel的皮膚類器官成熟培養基進行一次半量換液；

20、s6、誘導分化第18天至第45天，每3天用皮膚類器官成熟培養基進行一次半量換液；

21、s7、從誘導分化第45天起，每2天用皮膚類器官成熟培養基進行一次半量換液，每周用皮膚類器官成熟培養基進行一次全換液，培養至第85～100天，即得初級皮膚類器官。

22、由此，制得的初級皮膚類器官，角質形成細胞分化蛋白loricrin和filaggrin已分化，并且類器官足夠厚，可以切成碎片或進行解剖，并且易于處理。

23、在一些實施方式中，步驟(4)中，可以將gelma膠滴在初級皮膚類器官和脫細胞豬皮切片之間，并通過藍光照射使gelma膠固化，從而將初級皮膚類器官接種在脫細胞豬皮上。

24、在一些實施方式中，步驟(4)中將復合物進行氣液界面培養的方法可以包括如下步驟：

25、將復合物加入transwell小室內，然后加入皮膚類器官成熟培養基，皮膚類器官成熟培養基不能浸沒初級復合物中的皮膚類器官，以形成氣液培養界面，培養過程中，每3天進行一次全量換液。

26、在一些實施方式中，皮膚類器官成熟培養基的組成包括：基礎培養基、1×glutamax、0.5×b-27minus維生素a、0.5×n-2補充劑、0.1mm?2-巰基乙醇以及100μg/mlnormocin，其中，基礎培養基由advanced?dmem/f-12和neurobasal培養基按體積比1:1組成。

27、在一些實施方式中，脫細胞豬皮可以為市售的脫細胞豬皮基質。

28、在一些實施方式中，脫細胞豬皮的制備方法可以包括如下步驟：

29、a1)取豬皮，清洗、滅菌后，-80℃冰凍4h，室溫解凍，重復冰凍和解凍過程10次；

30、a2)將末次解凍后的豬皮置于2％?sds中，350rpm室溫振蕩36h；然后取出豬皮，置于含2％青鏈霉素雙抗的1％?triton?x-100中，350rpm室溫振蕩12h；

31、a3)取出豬皮，置于4％脫氧膽酸鈉水溶液中，200rpm、室溫條件下振蕩2h，取出豬皮依次用蒸餾水、3.4m?nacl溶液去蛋白、含有10μg/ml?dnase和5μg/ml?rnase的溶液去核酸，干燥，滅菌，即得。

32、由此，制得的脫細胞豬皮脫細胞徹底，結構疏松多孔，dna殘留量合格。與市售的脫細胞豬皮基質相比，本發明提供的脫細胞豬皮膠原保存更為完整。

33、在一些實施方式中，用3.4m?nacl溶液去蛋白具體可以包括如下步驟：將清洗后的豬皮置于3.4m?nacl溶液中，350rpm、室溫條件下振蕩1h，取出豬皮，室溫下用pbs緩沖液清洗。

34、在一些實施方式中，用含有10μg/ml?dnase和5μg/ml?rnase的溶液去核酸具體可以包括如下步驟：將經去蛋白處理后的豬皮置于含有10μg/ml?dnase和5μg/ml?rnase的pbs緩沖液中，350rpm、37℃條件下振蕩1h，取出豬皮，用pbs緩沖液清洗。

35、根據本發明的另一個方面，提供了一種uvb誘導的皮膚類器官衰老模型的制備方法，包括如下步驟：

36、將本發明的組織工程皮膚類器官加入pbs緩沖液中，uvb輻照5～10min后加入皮膚類器官成熟培養基繼續培養24h，即得。

37、經uvb輻照后的組織工程皮膚類器官的β半乳糖苷酶活性提高，衰老相關分泌表型tnf-α、il-6、il-8、mmp-2表達增加，sod的生成下降，表明uvb能誘導的人皮膚類器官衰老，uvb誘導的皮膚類器官衰老模型成功構建。

38、在一些實施方式中，uvb輻照的波長可以為302nm，強度可以為900μw/cm2。

39、本發明提供的uvb誘導的皮膚類器官衰老模型可應用于抗光老化材料的篩選、抗光老化材料作用機制的研究等。